張舒翔， 康大成， 張麗麗， 周光宏， 張萬剛

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心/肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210095)

我國是傳統(tǒng)養(yǎng)鵝大國，鵝肉產(chǎn)量已達(dá)世界總產(chǎn)量的90%以上,截至2014年我國鵝肉年產(chǎn)量已達(dá)246.55萬t。我國地方鵝種類豐富，揚(yáng)州鵝是江蘇和上海地區(qū)主要食用鵝種之一[1]。研究表明，揚(yáng)州鵝胸肌含有豐富的多不飽和脂肪酸及必需脂肪酸，相比于其他禽肉，鵝肉的品質(zhì)更加優(yōu)良[2]。

有研究表明，由運(yùn)輸造成的肉雞死亡率在0.5%～3%[3]，胴體損傷率甚至高達(dá)25%。因此，運(yùn)輸已成為禽類宰前管理中的重要環(huán)節(jié)，是影響動(dòng)物福利的主要因素之一。禽類在運(yùn)輸過程中會(huì)產(chǎn)生運(yùn)輸應(yīng)激，其原因通常是道路顛簸、溫濕度和混群等環(huán)境變化、禁食禁水等，使機(jī)體心跳加快、呼吸急促、急躁不安，體內(nèi)水分、營養(yǎng)急劇消耗，礦物質(zhì)代謝失常，最終影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能和免疫水平，導(dǎo)致肉品質(zhì)下降[4-5]。隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展和交通的便利，運(yùn)輸時(shí)間的延長漸漸成為影響運(yùn)輸應(yīng)激的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間運(yùn)輸會(huì)造成動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)加劇，機(jī)體內(nèi)糖酵解反應(yīng)加快，產(chǎn)生大量乳酸，使肌肉顏色蒼白，質(zhì)地松軟，缺乏彈性，表面有汁液滲出，導(dǎo)致肉品質(zhì)下降[6-7]，甚至引起死亡率的增加[8]。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，長距離運(yùn)輸后動(dòng)物機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一定的適應(yīng)性，導(dǎo)致應(yīng)激水平下降[9]。因此，研究通過分析運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝應(yīng)激程度和肉品質(zhì)的影響，為企業(yè)制定宰前運(yùn)輸及管理方案提供數(shù)據(jù)支撐和理論參考，以降低運(yùn)輸應(yīng)激造成的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用78日齡揚(yáng)州鵝30只。促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、皮質(zhì)酮激素(corticosterone，CORT)試劑盒購自赫澎(上海)生物科技有限公司；血糖(glucose，Glu)、乳酸(lactic acid，LD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)和己糖激酶(hexokinase，HK)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；碘乙酸鈉(sodium iodoacetate)購自南京巨優(yōu)科學(xué)器材有限公司；5′-三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)、5′-二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品、5′-一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品和肌苷酸(inosinic acid，IMP)購自Sigma公司；0.22 μm濾膜購自Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

肝素鈉一次性真空采血管,江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司；C- LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院；M2e型多功能酶標(biāo)儀,德國MD公司；FE20型臺(tái)式pH計(jì),瑞士Mettler Toledo公司；CR- 400型便攜式色差儀,日本Konica Minolta公司；Bertin Precellys Evolution 生物樣品均質(zhì)器,法國Bertin Technologies公司；AUY120型電子分析天平,日本SHIMADZU公司；SIM- F124型制冰機(jī),日本三洋公司；Waters 2695型HPLC儀,美國Waters公司；WH- Z型微型漩渦混合儀,上海瀘西分析儀器廠有限公司；MUL- 9000型系列純水機(jī),美國密理博公司；85- 2型恒溫磁力攪拌器,上海司樂儀器廠；Agilent 1100型色譜儀,安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

30只揚(yáng)州鵝隨機(jī)分為5個(gè)處理組，每組6只，運(yùn)輸時(shí)間分別為0、1、2、3、4 h，其中0 h為對(duì)照組。

運(yùn)輸條件：非混群運(yùn)輸，用尼龍繩將鵝腳掌緊縛在一起，隨機(jī)擺放在運(yùn)輸車(3.95 m×1.80 m×1.64 m)中，密度為0.24 m2/羽, 車內(nèi)溫度22 ℃，車外18 ℃；運(yùn)輸車采用小型有篷貨車，平均車速45 km/h。運(yùn)輸前12 h禁食，不禁水，運(yùn)輸全程禁食禁水。

宰殺流程：電擊暈(10 V、800 Hz，倒掛頭部浸水擊暈)→頸動(dòng)脈取血→放血→胴體熱燙(60～62 ℃)褪毛→剝離胸肌肉。

1.4 樣品制備

1.4.1血液樣品制備

參照張林等[10]的方法，稍加修改。鵝電擊暈后，用采血針從頸動(dòng)脈收集10 mL血液于肝素鈉抗凝管中，立即顛倒180°，混勻5～8次，在3 500 r/min的條件下離心5 min，取上清液分裝于2 mL試管，并-80 ℃保存待測。

1.4.2肌肉樣品制備

第一次熱燙褪毛以后，在 15 min 內(nèi)完整剝離左右2塊胸大肌，其右側(cè)胸肌用于測定宰后15 min的肌肉pH值、肉色，然后真空包裝于4 ℃保存24 h后，測定肌肉保水性和嫩度;左側(cè)胸肌于-80 ℃保存，用于測定能量代謝。

1.5 血液指標(biāo)測定

ACTH和CORT含量用酶聯(lián)免疫雙抗夾心試劑盒測定；Glu、LD含量與LDH、CK活力用試劑盒測定。所有操作均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 肌肉指標(biāo)測定

1.6.1肉色測定

參照Xing等[11]的方法，稍作修改。將樣品放置平整，用手術(shù)刀橫切出平整切面，于空氣中暴露10 min。選取肉色較為均勻的平整切面，用校準(zhǔn)后的色差儀測定胸肉色澤，記錄亮度L*、紅度a*、黃度b*。每個(gè)樣品選取等距離的3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測定，以其平均值作為肉色的測定結(jié)果。

1.6.2肌肉pH值測定

參照McGeehin等[12]的方法并稍作修改。稱取1 g樣品，加入9 mL預(yù)冷勻漿緩沖液(5 mmol/L碘乙酸鈉，150 mmol/L氯化鉀，pH值 7.0)，6 000r/min勻漿2×15 s，間隔5 s，將已校準(zhǔn)的pH計(jì)插入勻漿液測定pH值。

1.6.3貯藏?fù)p失測定

參照周光宏等[13]的方法并稍作修改。將右側(cè)胸肌邊緣部分切去，修整至形狀規(guī)則(10 cm×5 cm×1.5 cm)重約90 g的肉樣，稱重W1，真空包裝后，4 ℃儲(chǔ)藏24 h后取出樣品，用吸水紙擦去樣品表面滲出的水分，重新稱重W2。貯藏?fù)p失=(W1-W2)/W1×100%。

1.6.4蒸煮損失測定

參照周光宏等[13]的方法并稍作修改。取80 g左右胸肉，準(zhǔn)確稱重(W1)后密封在自封袋中，75 ℃水浴加熱，當(dāng)中心溫度達(dá)到72 ℃時(shí)取出肉塊，流水冷卻至室溫，取出用吸水紙擦干，稱重(W2)。蒸煮損失=(W1-W2)/W1×100%。

1.6.5剪切力測定

參照Froning等[14]的方法并稍作修改。將測定蒸煮損失后的樣品表面稍作修整，平行于肌纖維方向切取4 cm×1 cm×1 cm肉樣5塊，使用肌肉嫩度儀測定肉樣的剪切力值，上機(jī)試樣時(shí)，刀口與肌纖維走向垂直。

1.6.6肌肉中LD含量、HK和PK激酶活力測定

采用試劑盒測定每克肌肉蛋白質(zhì)中LD含量及HK和PK活力，所有操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.6.7肌肉中ATP、ADP、AMP和IMP含量測定

宰后肌肉中ATP、ADP、AMP和IMP的含量采用高效液相法(HPLC)測定并參照Shen等[15]的方法稍作修改。取1 g冷凍樣品，加入5 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)7%高氯酸(PCA)，8 000 r/min勻漿30 s，4 ℃下15 000 r/min離心10 min。上清液用KOH調(diào)節(jié)pH值為6.8，4 ℃下15 000 r/min離心10 min，定容至20 mL，0.22 μm濾膜過濾。檢測波長254 nm，流動(dòng)相為86.5 g/mL磷酸緩沖液(2.5 mmol/L四丁基硫酸氫氨，0.04 mol/L磷酸二氫鉀，0.06 mol/L磷酸氫二鉀，pH 值7.0)和體積分?jǐn)?shù)13.5%甲醇，流速1 mL/min，進(jìn)樣10 μL。結(jié)果最后用外標(biāo)法，通過保留時(shí)間和峰面積對(duì)核苷酸進(jìn)行定性和定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)共分為5個(gè)處理組，每個(gè)處理組有6個(gè)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均采用SAS 9.2進(jìn)行方差分析。采用Fisher最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行顯著性(p<0.05)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝血液指標(biāo)的影響

ACTH和CORT 兩種激素含量可直觀反映機(jī)體的應(yīng)激水平[16]。隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長，ACTH含量呈先升高后下降再升高的趨勢，2 h運(yùn)輸后ACTH含量顯著高于其余處理組(p<0.05)；2 h運(yùn)輸后CORT含量顯著高于對(duì)照組和4 h運(yùn)輸組(見表1)。2 h運(yùn)輸后血液中Glu濃度顯著高于其余處理組(p<0.05)，4 h運(yùn)輸后Glu濃度略有上升；2 h運(yùn)輸后血液中LD濃度顯著低于其他運(yùn)輸時(shí)間組(p<0.05)。CK和LDH活性均隨運(yùn)輸時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，且2 h運(yùn)輸后血液中2種酶的活性都顯著高于對(duì)照組和4 h運(yùn)輸組(p<0.05)。

表1 運(yùn)輸時(shí)間與揚(yáng)州鵝血液指標(biāo)水平的關(guān)系

同列數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝宰后能量代謝的影響

肌肉中LD含量隨運(yùn)輸時(shí)間呈先增多后減少的趨勢，2 h運(yùn)輸組LD含量顯著高于對(duì)照組、1 h和4 h運(yùn)輸組(p<0.05)，這與pH值的變化相符，見表2。PK和HK活性均隨運(yùn)輸時(shí)間呈先升高后降低的趨勢，2 h運(yùn)輸后PK活性顯著高于對(duì)照組、3 h和4 h運(yùn)輸組(p<0.05)；2 h運(yùn)輸后HK活性顯著高于對(duì)照組、1 h和4 h運(yùn)輸組(p<0.05)。

ATP含量隨運(yùn)輸時(shí)間的延長呈降低的趨勢，運(yùn)輸處理后，ATP含量顯著低于對(duì)照組(p<0.05)；ADP和AMP含量隨運(yùn)輸時(shí)間的延長呈上升的趨勢，3 h和4 h運(yùn)輸后，ADP含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，2～4 h運(yùn)輸后，AMP含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)；1 h和4 h運(yùn)輸后，IMP含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，見表3。

表2 運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝宰后肌肉中LD含量和PK、HK活性的影響

同列數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

表3 運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝宰后肌肉中ATP、ADP、AMP和IMP含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝肌肉品質(zhì)的影響

肉色方面，L*值隨運(yùn)輸時(shí)間延長呈先增大后減小的趨勢，2 h運(yùn)輸后L*值顯著高于其余處理組(p<0.05)；a*值隨運(yùn)輸時(shí)間延長呈先減小后增大的趨勢，2 h運(yùn)輸后a*值顯著低于其他運(yùn)輸時(shí)間組(p<0.05)；2 h運(yùn)輸后b*值顯著低于對(duì)照組(p<0.05)；pH值隨運(yùn)輸時(shí)間呈先降低后升高的趨勢，2 h和3 h運(yùn)輸組的pH值顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，見表4。

表4 運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝肌肉色澤的影響

同列數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

貯藏?fù)p失和蒸煮損失均隨運(yùn)輸時(shí)間延長呈先增大后減小的趨勢，2 h運(yùn)輸后貯藏?fù)p失顯著高于對(duì)照組、3 h和4 h運(yùn)輸組(p<0.05)；1 h和2 h運(yùn)輸后蒸煮損失顯著高于對(duì)照組和4 h運(yùn)輸組(p<0.05)；此外，剪切力隨運(yùn)輸時(shí)間延長呈先增大后減小的趨勢，2 h運(yùn)輸后剪切力顯著高于其余處理組(p<0.05)，見表5。

表5 運(yùn)輸時(shí)間對(duì)揚(yáng)州鵝肌肉保水性和嫩度的影響

同列數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

3 討 論

3.1 運(yùn)輸時(shí)間與揚(yáng)州鵝血液應(yīng)激指標(biāo)變化的關(guān)系

運(yùn)輸過程中，動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，其HPA軸功能增強(qiáng)，大量ACTH被釋放進(jìn)入血液到達(dá)腎上腺皮質(zhì)區(qū)域，促進(jìn)腎上腺迅速合成皮質(zhì)激素(鵝為皮質(zhì)酮激素CORT)，血液中CORT含量增高[17]；因此，鵝血漿中CORT水平可以作為反應(yīng)應(yīng)激水平的有效指標(biāo)。許利凡等[18]研究發(fā)現(xiàn)夏南牛在長時(shí)間的運(yùn)輸過程中，ACTH和CORT含量呈先上升后下降的趨勢。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論，說明運(yùn)輸處理引起了鵝機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)長時(shí)間的運(yùn)輸使鵝機(jī)體對(duì)應(yīng)激產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。但4 h運(yùn)輸后，血漿中ACTH含量有所上升，其可能是因?yàn)檫^長時(shí)間禁食導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)能量消耗過大，為維持正常的生理活動(dòng)，機(jī)體需加劇糖酵解反應(yīng)，故激素水平上升，應(yīng)激加強(qiáng)[19]。鵝體內(nèi)CORT含量的提高引起糖酵解反應(yīng)加劇[20]，產(chǎn)生大量LD并進(jìn)入血液，使血液中LD含量升高。LD的大量堆積激活肝臟和骨骼肌細(xì)胞中的糖異生途徑，將大量LD轉(zhuǎn)變成Glu，并釋放進(jìn)入血液，從而導(dǎo)致Glu含量的上升。本研究中4 h運(yùn)輸后LD濃度降低，可能與過長時(shí)間禁食導(dǎo)致鵝機(jī)體饑餓虛弱，糖原含量減少，糖酵解反應(yīng)維持在一個(gè)較低的水平有關(guān)[5]。CK和LDH均為胞內(nèi)酶，由于細(xì)胞的屏障作用，僅有少量CK和LDH隨細(xì)胞新陳代謝釋放到血液中。動(dòng)物應(yīng)激時(shí)，肌細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致肌肉中CK和LDH逸出進(jìn)入血液[21]。蘆春蓮等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肉牛運(yùn)輸后血液中CK和LDH含量顯著提高。因此，隨應(yīng)激程度的增加，血液中CK和LDH濃度會(huì)不斷提高，這與本研究結(jié)果類似，但3～4 h運(yùn)輸后，CK和LDH活性呈下降趨勢，可能是由于長時(shí)間運(yùn)輸，使機(jī)體產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。

3.2 運(yùn)輸時(shí)間與揚(yáng)州鵝宰后能量代謝的關(guān)系

動(dòng)物應(yīng)激時(shí)機(jī)體能量需求增加，糖酵解反應(yīng)加劇，肌糖原降解轉(zhuǎn)化成Glu，肌肉中Glu含量的增加激活了HK，使HK活力提高，加快ATP放能，生成大量ADP。Glu經(jīng)過糖酵解反應(yīng)，生成丙酮酸和ATP。丙酮酸含量的升高，導(dǎo)致PK活性增強(qiáng)并被PK轉(zhuǎn)化為LD。而糖酵解的速率受PK活力的影響，PK活力的提高反過來會(huì)加速糖酵解的進(jìn)行[23]。當(dāng)動(dòng)物應(yīng)激加劇時(shí)，無氧代謝增強(qiáng)，能量需求進(jìn)一步加強(qiáng)，導(dǎo)致ADP水解生成AMP并釋放更多能量，而AMP脫氨后可生成IMP。研究中發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸處理后，機(jī)體消耗了大量的能量，導(dǎo)致ATP含量顯著低于對(duì)照組。而運(yùn)輸3～4 h后，機(jī)體內(nèi)能量消耗過多，沒有足夠能量供ADP轉(zhuǎn)化為ATP，導(dǎo)致ADP和AMP含量升高，這與ATP含量的變化一致。4 h運(yùn)輸后，IMP含量顯著高于對(duì)照組，其可能是因?yàn)殚L時(shí)間的禁食導(dǎo)致機(jī)體虛弱，能量缺乏，IMP不斷累積造成的。

3.3 運(yùn)輸時(shí)間與揚(yáng)州鵝肌肉品質(zhì)的關(guān)系

肉色是反映鵝肉品質(zhì)最直觀的指標(biāo)。應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)糖酵解反應(yīng)加劇，產(chǎn)生大量LD，LD的大量積累使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能被破壞，同時(shí)應(yīng)激產(chǎn)生的自由基可加速脂質(zhì)氧化，使細(xì)胞失活，最終導(dǎo)致肌肉保水力下降，細(xì)胞液釋出，令肌肉表面潮濕，反射自然光增加，L*值增大，a*值減小，肌肉呈灰白色[21]。本研究發(fā)現(xiàn)2～3 h運(yùn)輸后b*值顯著低于對(duì)照組，其原因尚不明確，有待進(jìn)一步探究。pH值是反應(yīng)肌肉品質(zhì)變化的重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，宰后肌肉pH的過快下降，易致肌肉保水力變差，汁液流失嚴(yán)重，從而導(dǎo)致PSE肉的產(chǎn)生[21]。翁愷麒等[24]研究發(fā)現(xiàn)隨運(yùn)輸時(shí)間的延長，肉鴨pH值呈先下降后上升的趨勢，2 h運(yùn)輸后降至最低且顯著低于對(duì)照組，這與本研究的結(jié)果一致。保水性和嫩度是反映肌肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是類PSE肉判定的重要依據(jù)之一。應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物pH值快速下降，破壞了肌細(xì)胞膜的功能結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肉保水性下降[25]，同時(shí)動(dòng)物肌細(xì)胞內(nèi)能量消耗較大，肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白結(jié)合形成的肌動(dòng)球蛋白沒有足夠的能量分開，導(dǎo)致肌肉收縮，剪切力變大，嫩度降低[26]。張巖等[21]研究發(fā)現(xiàn)肉雞滴水損失隨運(yùn)輸時(shí)間的延長而增大，說明應(yīng)激程度越高，肉的保水性越差，這與本研究的結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)，2 h運(yùn)輸后肌肉剪切力值顯著提高，說明機(jī)體內(nèi)能量缺乏，肌動(dòng)球蛋白沒有足夠的能量分解為肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，導(dǎo)致剪切力上升，這與肌肉中ATP和ADP的含量變化一致。以上結(jié)果說明2 h運(yùn)輸后，鵝肉品質(zhì)明顯變差，鵝機(jī)體應(yīng)激水平較高。

4 結(jié) 論

2 h運(yùn)輸后，鵝機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)明顯，血液中激素水平明顯上升，使糖酵解反應(yīng)加劇，Glu含量顯著增加，LD含量減少，CK、LDH、HK和PK活力顯著增加，大量的能量被消耗；肌肉中LD大量積累，導(dǎo)致pH值迅速降低，破壞了細(xì)胞膜的功能結(jié)構(gòu)，使肉色變差，保水性和嫩度下降，肉品質(zhì)顯著降低，并增加了類PSE肉發(fā)生的可能性。3～4 h運(yùn)輸后，血液中激素水平下降，Glu含量減少，LD含量增多，CK、LDH、HK和PK活力下降；肌肉中LD含量減少，能量代謝水平降至平穩(wěn)，機(jī)體虛弱，但肉色、保水性和嫩度仍處于較差水平，說明長時(shí)間運(yùn)輸后機(jī)體產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性。因此，運(yùn)輸時(shí)間的延長會(huì)加劇鵝機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，且2 h運(yùn)輸后應(yīng)激反應(yīng)最大，過長時(shí)間的運(yùn)輸使機(jī)體產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性，但易致機(jī)體虛弱。