薛意斌， 任志遠， 樊筱園， 楊 華， 黃朝波， 楊明冠，李貞景， 王昌祿

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室， 天津 300457)

紅曲，又名丹曲，是我國重要食用、藥用真菌，是傳統(tǒng)中藥紅曲的基原菌，也是制作傳統(tǒng)飲品紅曲酒的主要菌種[1-2]。目前，在我國應(yīng)用最為廣泛的主要紅曲菌種有：安卡紅曲菌(M.anka)、煙色紅曲菌(M.fuliginosus)、紫色紅曲菌(M.prupureus)、紅色紅曲菌(M.ruber)和叢毛紅曲菌(M.pilosus)等[3]。1979年，Endo等[4]在紅曲霉發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了一種能特異性地抑制膽固醇合成的物質(zhì)，該物質(zhì)與土曲霉(Aspergillusterreus)產(chǎn)的洛伐他汀(Lovastatin)為同一物質(zhì)，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的降膽固醇藥物之一[5-6]。莫納可林K作為紅曲霉多種功能代謝產(chǎn)物之一，分為內(nèi)酯型和酸型兩種，在一定條件下兩者可以轉(zhuǎn)換[7-9]。莫納可林K作為眾多莫納可林化合物中活性較強的物質(zhì)[10]，既能抑制膽固醇的合成又能保護內(nèi)皮祖細胞[11]、抑制腫瘤細胞[12]等。

甘油作為常用碳源之一，對紅曲菌生長和代謝有著重要作用，且不會產(chǎn)生碳代謝物阻遏效應(yīng)[13]。然而，關(guān)于紅曲霉利用甘油發(fā)酵產(chǎn)莫納可林K的研究相對較少[14]。本文擬研究甘油對紅曲霉CG-6發(fā)酵過程中莫納可林K產(chǎn)量的影響，并采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)對其合成相關(guān)基因進行分析，探討甘油對紅曲霉CG-6莫納可林K的代謝調(diào)控機理，希望本研究能夠為利用甘油等碳源提高紅曲霉發(fā)酵中莫納可林K產(chǎn)量提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

菌種：煙色紅曲霉CG-6(MonascusCG-6)，保藏于天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院發(fā)酵食品與生物資源開發(fā)實驗室。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，康為世紀(jì)生物技術(shù)公司；GoldviewI型核酸染色劑、1kb plus DNA Ladder、6×DNA Loading Buffer，北京索萊寶生物有限公司；莫納可林K標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)，美國Sigma公司；甘油、瓊脂粉、蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW- CJ- 1FD型超凈工作臺，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LS- B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；KCL2000型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，日本EYELA東京理化公司；AG22331型高速離心機，德國Eppendorf公司；070- 851型PCR儀，德國Biometra公司；SU1510型掃描電子顯微鏡，株式會社日立制作所；1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1紅曲霉CG-6種子液制備及發(fā)酵方法

紅曲霉CG-6菌種斜面加入5 mL無菌水，接種環(huán)刮下孢子，倒入100 mL種子液培養(yǎng)基(葡萄糖6 g，蛋白胨2 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，自來水100 mL，121 ℃滅菌20 min)中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，四層紗布過濾，調(diào)整孢子濃度至106個/mL，待用。已滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(種子液培養(yǎng)基中添加3%瓊脂)倒入平板，取200 μL種子液鋪滿玻璃紙表面，28 ℃培養(yǎng)。添加不同濃度甘油為實驗組，每組3個平行。

1.3.2紅曲霉CG-6莫納可林K檢測

從鋪有玻璃紙平板分別取紅曲霉發(fā)酵物(胞內(nèi))和培養(yǎng)基底物(胞外)，烘干至恒重，磨粉過100目篩。分別取0.50 g，加入4 mL 75%乙醇混勻，超聲30 min，4000 r/min離心10 min，向沉淀中再加3 mL 75%乙醇混勻，超聲30 min，4 000 r/min離心10 min。重復(fù)此操作，合并3次上清液，過膜進行高效液相色譜檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算莫納可林K產(chǎn)量。

色譜柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相為乙腈∶水=60∶40，水相加0.1%甲酸；分別將有機相、水相過膜，超聲脫氣30 min。檢測器為DAD檢測器，檢測波長237 nm；柱溫為25 ℃；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL[15]。

1.3.3甘油對紅曲霉CG-6 莫納可林K合成相關(guān)基因表達量的影響實驗

從平板取面積4 cm2紅曲霉菌絲體，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，酶標(biāo)儀檢測RNA濃度，于-80 ℃保存，備用。以RNA為模板，稀釋至150 ng/μL，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行RT-qPCR實驗，采用Actin(Gen Bank accession No.AJ417880.1)基因作為內(nèi)參基因，進行莫納可林K合成相關(guān)基因表達量測定。通過Premier 5軟件設(shè)計基因mokA-mokI引物[16]。RT-qPCR反應(yīng)體系如表1，反應(yīng)程序如表2。每個反應(yīng)做3個平行實驗，重復(fù)1次。通過MxPro軟件，采用相對定量分析2-△△Ct法，對莫納可林K合成相關(guān)基因表達量進行分析[17]。

表1 SYBR Green實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

表2 RT-qPCR程序

2 結(jié)果與分析

2.1 莫納可林K標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

圖1 莫納可林K高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Monacolin K

檢測莫納可林K標(biāo)準(zhǔn)品和紅曲霉CG-6發(fā)酵樣品。酸型和內(nèi)酯型莫納可林K標(biāo)準(zhǔn)品保留時間分別為5.758、10.797 min。通過時間和光譜圖(見圖1)，確定樣品中酸型和內(nèi)酯型莫納可林K保留時間分別為5.735、11.116 min。酸型和內(nèi)酯型莫納可林K標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=59.947x+29.11，R2=0.999 5；y=60.49x-7.42，R2=0.999 0，兩個方程具有顯著相關(guān)性。

2.2 甘油濃度對紅曲霉CG-6胞內(nèi)莫納可林K積累的影響

培養(yǎng)9 d，添加0～12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油對紅曲霉CG-6胞內(nèi)莫納可林K積累量結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著甘油濃度增加，胞內(nèi)酸型和內(nèi)酯型莫納可林K積累量呈先增加后減少趨勢；濃度為8%時，酸型和內(nèi)酯型莫納可林K積累量達到最大，分別為5 957.5、3 516.9 μg/(g干菌重)，其中酸型占總莫納可林K的63%；當(dāng)甘油濃度大于8%時，酸型和內(nèi)酯型莫納可林K積累量均開始下降，這可能是由于在該過程中過量甘油使脫水酶快速自殺性失活[18]。

圖2 甘油濃度對紅曲霉CG-6胞內(nèi)莫納 可林K積累量的影響Fig.2 Effect of glycerol concentrations on biomass and Monacolin K output in Monascus CG-6

2.3 甘油濃度對紅曲霉CG-6胞外莫納可林K積累的影響

培養(yǎng)9 d，添加0～12%甘油對紅曲霉CG-6胞外莫納可林K積累量結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著甘油濃度增加，胞外酸型和內(nèi)酯型莫納可林K積累量呈先增加后減少趨勢。濃度為8%時，酸型和內(nèi)酯型莫納可林K積累量達到最大，分別為4 468.1、2 537.7 μg/(g干菌重)，其中酸型占總莫納可林K的64%；同時結(jié)合圖2，胞外和胞內(nèi)總莫納可林K產(chǎn)量相比，胞外占胞內(nèi)總莫納可林K積累量的73.9%，這與以往研究結(jié)果胞外總莫納可林K積累量遠小于胞內(nèi)不同。已有研究結(jié)果表明，甘油可通過影響脂肪酸的組成增加細胞膜通透性，進而有利于次級代謝產(chǎn)物外排[19-20]，因此，胞外總莫納可林K積累量的增加可能是因為甘油作為碳源能促進紅曲霉胞內(nèi)總莫納可林K的外排。

2.4 甘油為碳源時不同培養(yǎng)時間對莫納可林K合成相關(guān)基因表達量的影響

甘油濃度為8%，不同培養(yǎng)時間對莫納可林K合成相關(guān)基因表達量的影響見圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)時間延長，紅曲霉CG-6莫納可林K合成相關(guān)基因mokA、mokD、mokE、mokG、mokH、mokI表達量較對照組逐漸升高，mokB、mokC表達量變化不大，mokF表達量逐漸下降；培養(yǎng)前期，莫納可林K合成基因簇整體表達量都不高，隨著培養(yǎng)時間延長，

圖3 甘油濃度對紅曲霉CG-6胞外莫納 可林K積累量的影響Fig.3 Effect of glycerol concentrations on extracellular Monacolin K output in Monascus CG-6

莫納可林K合成相關(guān)基因表達量有所上升，且在培養(yǎng)9 d時，mokE、mokI表達量分別比對照組升高了240%、146%，這可能與紅曲霉CG-6分解甘油所需相關(guān)脫水酶、脫氫酶的積累有關(guān)[21]。

2.5 甘油濃度對莫納可林K基因表達量的影響

培養(yǎng)9 d，添加6%～8%甘油對莫納可林K基因表達量的影響見圖5。由圖5可知，隨著甘油濃度增加，mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH表達量呈先升高后降低趨勢，mokA表達量逐漸升高，mokI表達量變化不大；甘油濃度為8%時，mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH表達量分別較對照組升高了11%、32%、23%、24%、43%、22%、16%、33%，這些基因高效表達促進莫納可林K積累；隨甘油濃度進一步增加，mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH出現(xiàn)下調(diào)趨勢，從而引起莫納可林K積累量下降，這與圖2和圖3中莫納可林K的變化趨勢相一致。

圖4 甘油為碳源時不同培養(yǎng)時間對莫納可林K合成相關(guān)基因表達量的影響Fig.4 Effect of glycerol on expression levels of Monacolin K synthesis related genes in different periods

圖5 不同甘油濃度對莫納可林K基因表達量的影響Fig.5 Effect of glycerol at different concentrations on expression of Monacolin K Genes

3 結(jié) 論

研究了甘油對紅曲霉CG-6莫納可林K合成及相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果表明：甘油濃度為0～12%時，隨其濃度增加，胞內(nèi)和胞外總莫納可林K積累量都呈先增加后減少趨勢；甘油濃度為8%時，有利于酸型和內(nèi)酯型莫納可林K合成，其中胞外總莫納可林K的積累量為7 005.8 μg/(g干菌重)，占胞內(nèi)總莫納可林K積累量的73.9%；隨著培養(yǎng)時間延長，莫納可林K合成相關(guān)基因mokA、mokD、mokE、mokG、mokH、mokI表達量較對照組逐漸升高，mokB、mokC表達量變化不大，mokF表達量逐漸下降；甘油濃度大于8%且培養(yǎng)9 d時，mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH出現(xiàn)下調(diào)趨勢，基因表達量的下調(diào)引起莫納可林K積累量下降。