劉佳秀， 查振興， 于文溪， 董 雪， 王 勛， 妥彥峰

(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034)

中國水產(chǎn)品資源豐富，2016年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量已達(dá)6 901.25萬t[1]。水產(chǎn)品中含有高蛋白，以及能夠減少心血管疾病的不飽和脂肪酸，除此之外還含有人體所需重要礦物質(zhì)以及維生素，因此深受消費(fèi)者的青睞[2]。然而高含量的小分子含氮化合物，以及適合病原菌和腐敗菌生長的中性pH值環(huán)境，使水產(chǎn)品成為一種極易腐敗的食品，腐敗后的水產(chǎn)品質(zhì)量下降，造成經(jīng)濟(jì)損失[3]。

在魚類運(yùn)輸及銷售過程中必須有一定的保鮮手段，我國當(dāng)下主要使用化學(xué)和物理保藏方式，其中化學(xué)，如亞硝酸鹽，對人體有一定的危害[4-5]；物理保鮮中冷凍在解凍后會造成汁液外滲，而高溫處理會造成食品感官缺陷[6]。天然、安全的保鮮方式受到消費(fèi)者歡迎。乳酸菌廣泛存在于發(fā)酵食品以及人和動物的腸道內(nèi)，是一種普遍認(rèn)為安全的微生物[7]。而且乳酸菌具有廣泛的抑菌譜，利用乳酸菌防止食品中腐敗菌生長具有悠久的歷史和優(yōu)良的保藏效果[5,8]。利用乳酸菌作用生物保鮮劑對魚肉進(jìn)行保鮮也受到了廣泛的關(guān)注[7，9]，但缺乏系統(tǒng)性。乳酸菌應(yīng)用于水產(chǎn)品的保鮮，其對魚肉中常見有害菌生長的抑制作用、對魚肉的潛在致腐性是作為篩選魚肉生物保鮮劑的前提[10]。

文章研究了大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏的海洋魚類來源乳酸菌對魚肉中常見有害菌的抑菌特性及其對魚肉的潛在致腐性，篩選出3株高抑菌性的乳酸菌，并研究了乳酸菌防止有害菌腐敗魚肉的潛在特性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與方法

1.1.1材料與試劑

黃花魚，大連市樂購超市；阿拉伯膠(分析純)，上海源葉生物試劑有限公司；硼酸、碳酸鉀(分析純)，天津大茂化工廠；LB、MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器與設(shè)備

S210- K型SEVENCOMPACT pH計(jì)，Mettler Toledo儀器有限公司；Multiskan GO型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；FS- 1C- 50型冷凍離心機(jī)，德國HERMLE Labortechnik GmbH公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)中使用乳酸菌(LABs)以及指示菌如表1。所用乳酸菌均由大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離自海洋魚類，并經(jīng)過16S rRNA序列分析鑒定。

表1 乳酸菌和指示菌信息以及培養(yǎng)條件

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌抑菌實(shí)驗(yàn)

采用平板擴(kuò)散法測定備選乳酸菌對指示菌生長的抑制作用。乳酸菌處理：將培養(yǎng)至第2代的乳酸菌OD600值調(diào)至1.0左右，按照2%接種量進(jìn)行接種，100 μL菌懸液接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h后，將乳酸菌培養(yǎng)液離心(8 000r/min，10 min，4 ℃)得上清液(CFS)，備用。

指示菌處理：將傳代3代的致病菌OD600值調(diào)節(jié)至0.25左右，按照2%接種量，將致病菌接入分裝好的20 mL LB固體培養(yǎng)基中，搖勻、備用。

培養(yǎng)基制備：在平板底部鋪上15 mL左右的素瓊脂(2 g瓊脂/100 mL去離子水)，晾干；放置牛津杯，每個(gè)平板中放置4個(gè)；將含有指示菌的LB固體培養(yǎng)基傾注到平板中，晾干1 h；每個(gè)孔接入200 μL乳酸菌CFS，37 ℃培養(yǎng)2 d，使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大?。凰袑?shí)驗(yàn)做3次平行。

1.2.2菌懸液及魚塊的制備方法

乳酸菌菌懸液制備：將4 ℃保藏的乳酸菌經(jīng)MRS肉湯活化2代，梯度稀釋進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果，使用滅菌生理鹽水將活化好的乳酸菌進(jìn)行稀釋，獲得不同濃度的乳酸菌菌懸液。

黃花魚魚塊制備：將從大連市超市購買的黃花魚去骨，去尾，去除內(nèi)臟，用無菌蒸餾水進(jìn)行清洗。將魚肉切割成10 g左右的生魚片，將各個(gè)樣品在其相對應(yīng)的乳酸菌菌懸液中浸漬30 min，取出瀝干3～5 min，放入經(jīng)過高溫滅菌的培養(yǎng)皿，外部使用體積分?jǐn)?shù)75%酒精滅菌保鮮膜覆蓋，放入4 ℃的冰箱儲存。實(shí)驗(yàn)過程中器具事先用75%酒精進(jìn)行消毒。

1.2.3滅菌魚汁的制備方法

根據(jù)Leroi等[9]的方法略有修改。取處理好的魚塊，使用打漿機(jī)打成泥狀；以m(蒸餾水)∶m(魚泥)=2∶1混勻，將混合物煮沸2 min；使用四層紗布進(jìn)行過濾，得到濾液；魚汁濾液在105 ℃下滅菌10 min，在-20 ℃下儲存，使用前4 ℃下解凍使用。

1.2.4pH值測定方法

pH值使用pH計(jì)測定。

1.2.5揮發(fā)性鹽基氮測定方法

根據(jù)GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[10]中描述的微量擴(kuò)散法進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVBN)測定。

1.2.6魚汁感官評價(jià)方法

根據(jù)Macé等[11]的方法略有修改：在實(shí)驗(yàn)室選6名具有食品感官評定專業(yè)知識的學(xué)生，經(jīng)過培訓(xùn)后，作為感官評定人員對接種乳酸菌的魚汁進(jìn)行感官評定。所有的魚汁樣品保存在滅菌試管中，保證其原有的風(fēng)味物質(zhì)。每次評定每種乳酸菌平行實(shí)驗(yàn)3組，進(jìn)行隨機(jī)標(biāo)號，隨機(jī)分配給6名評定人員進(jìn)行評分，分?jǐn)?shù)10～1分不等。未接入乳酸菌的魚汁作為空白對照。腐敗程度：Ⅰ未腐敗(10～9)、Ⅱ略微腐敗(8～7)、Ⅲ中度腐敗(6～5)、Ⅳ嚴(yán)重腐敗(4～1)，其中6為不可接受限。

1.2.7魚肉感官評價(jià)方法

2015年至2017年以及2018上半年，才府玻璃主營業(yè)務(wù)綜合毛利率分別為：30.94%、31.73%、29.62%和31.05%。如果加上2014年數(shù)據(jù)，才府玻璃綜合毛利率較為穩(wěn)定，整體看呈現(xiàn)小幅的上升趨勢，但基本保持在30%上下波動。

魚肉感官評價(jià)根據(jù)黃曉春等[12]略有修改。黃花魚肉以色澤、氣味、組織形態(tài)和肌肉彈性為檢驗(yàn)項(xiàng)目，分值分別為10～1分制，感官接受程度越高得分越高，以生魚片5項(xiàng)得分的平均值為魚肉感官評定結(jié)果，其中6分作為感官不可接受限。

1.2.8數(shù)據(jù)處理及繪圖

使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin Pro 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌魚汁菌落數(shù)量

滅菌魚汁在計(jì)數(shù)平板上，達(dá)到無菌的狀態(tài)，保證添加的菌種只有L.plantarumY12和Pseudomonasspp.，排除干擾，防止了其他雜菌的污染。

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究所用乳酸菌對7種魚肉中常見有害菌生長具有不同程度的抑制作用，結(jié)果見表2。其中對致病菌V.parahaemolyticus有明顯的抑制效果；對腐敗菌A.hydrophila的抑制效果最好，其次為S.marcescens，而對Pseudomonasspp.的抑制作用不如其他2株腐敗菌明顯。經(jīng)測定不同乳酸菌MRS發(fā)酵液pH值均為3.85左右，因此乳酸菌主要通過有機(jī)酸對有害菌生長產(chǎn)生抑制作用。使用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析(PCA)，得分見表2，其中主成分得分最高的為L.plantarumY12，其次為L.plantarumY42以及L.plantarumY3-1。

表2 平板擴(kuò)散法測定LABs的抑菌能力

“+”抑菌圈直徑≤15 mm， “++”抑菌圈直徑在15～17.5 mm，“+++”抑菌圈直徑在17.5～20 mm。

魚類、貝類等水產(chǎn)品表面有豐富的微生物群落，其中含有危害食品安全的致病菌以及使食品腐敗變質(zhì)的腐敗菌，尤其是水產(chǎn)品中特定腐敗菌[13]。Arena等[14]研究發(fā)現(xiàn)79株不同來源的植物乳桿菌發(fā)酵上清液對L.monocytogenes以及S.aureus有很好的抑制作用。季紅等[15]對10株L.plantarum的抑菌性能進(jìn)行研究，其中L.plantarumST-III所產(chǎn)的類細(xì)菌素物質(zhì)能夠抑制S.enterica以及S.aureus，并且在pH值5.0～6.5最為明顯。細(xì)菌素是乳酸菌產(chǎn)生的一種抑菌大分子，但乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素類物質(zhì)通常在低pH值條件下發(fā)揮抑菌作用[4,16]。文中6株從海魚中分離的乳酸菌有廣泛的抑菌譜，能夠抑制7種魚肉中常見的有害菌，但對不同菌株的抑制作用有所差異，可能與乳酸菌菌株所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)不同有關(guān)系。

2.3 乳酸菌對新鮮魚肉致腐實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將初篩獲得抑菌性較好的菌株L.plantarumY12、Y42、Y3-1，制備濃度為107CFU/mL的菌懸液，將黃花魚塊浸漬于菌懸液10 min，于4 ℃保藏8 d，測定保藏期間魚肉pH值及揮發(fā)性鹽基氮含量的變化，結(jié)果如圖1、圖2。

根據(jù)圖1和圖2，接入乳酸菌的魚肉pH值較未接乳酸菌的稍低，變化不顯著(p>0.05)。在保藏第3天時(shí)，ω(TVBN)小于10 mg/100 g，屬于一級鮮肉；第6天，未接菌的魚肉ω(TVBN)高達(dá)(18.45±0.24)mg/100 g，接入L.plantarumY12、Y3-1、Y42的魚肉ω(TVBN)分別為(12.39±0.10)、(15.07±0.25)、(15.15±0.12)mg/100 g，說明乳酸菌沒有腐敗魚肉，反而能夠抑制魚肉腐敗變質(zhì)。在第7天時(shí)，接菌和未接菌的魚肉的ω(TVBN)都超過國家標(biāo)準(zhǔn)(30 mg/100 g)[17]，魚肉已經(jīng)開始腐敗。在第8天時(shí)，其中浸漬L.plantarumY12菌懸液的魚肉ω(TVBN)為(38.91±0.20)mg/100 g，低于空白組(49.87±0.40) mg/100 g(p<0.05)。在整個(gè)保藏期內(nèi)L.plantarumY12不腐敗魚肉，并且展現(xiàn)了良好的保鮮能力，因此選擇L.plantarumY12進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 乳酸菌處理魚肉中pH值變化Fig.1 pH evolution in fresh fish meat juice at 4 ℃

圖2 乳酸菌處理魚塊中TVBN值變化Fig.2 Changes of TVBN in fresh fish meat juice at 4 ℃

近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在食品腐敗的后期，乳酸菌是其中主要的腐敗菌，尤其是氣調(diào)包裝后期。判斷乳酸菌是否能夠應(yīng)用于食品中，應(yīng)該考慮其是否對食品有一定的致腐性[7,18]，因此在保鮮實(shí)驗(yàn)之前，必須探究其是否對魚肉本身具有致腐性。Wiernasz等[19]在魚汁中觀察了35株乳酸菌的致腐性，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對魚肉沒有致腐作用。Macé等[20]在鮭魚中分離出的Lactococcuspiscium未造成鮭魚腐敗。乳酸菌存在于魚肉中，在自身的生長繁殖過程中，產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，pH值的測定是乳酸菌應(yīng)用于保鮮中一個(gè)指標(biāo)。很多研究表明，乳酸菌能夠有效地延長食品的保質(zhì)期，但是卻造成食品的酸化[21-22]。本實(shí)驗(yàn)整個(gè)保藏過程中和空白相比，3株乳酸菌沒有酸化魚肉的趨勢(p>0.05)，也未引起魚肉腐敗。

2.4 乳酸菌對滅菌魚汁保鮮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別制備4組新鮮的魚汁，乳酸菌組魚汁中接種體積分?jǐn)?shù)2%、濃度為107CFU/mL的L.plantarumY12菌懸液；Pseudomonasspp.組接種體積分?jǐn)?shù)2%、濃度為105CFU/mL的Pseudomonasspp.菌懸液；混合培養(yǎng)組分別接種體積分?jǐn)?shù)2%，濃度分別為107、105CFU/mL的Y12菌懸液以及Pseudomonasspp.菌懸液; 空白組不接入任何微生物。各組魚汁于8 ℃下保藏6 d，保藏期內(nèi)魚汁pH值和TVBN值變化分別見圖3、圖4。

研究乳酸菌的保鮮性能，滅菌的食品是一種理想的模型。根據(jù)圖3，未接入微生物的對照組魚汁由于無菌條件，在保藏的6 d里pH值始終處于6.9左右，且沒有變化(p>0.05)。單獨(dú)接種L.plantarumY12的魚汁全程pH值保持6.6左右，較第0天pH值6.9，有顯著下降(p<0.05)。腐敗菌單獨(dú)培養(yǎng)的魚汁pH值和空白相比有顯著下降(p<0.05)。乳酸菌和腐敗菌混合培養(yǎng)的魚汁整個(gè)保存過程中pH值先下降、再逐步上升，可能由于前期乳酸菌生長產(chǎn)酸pH值降低，后期腐敗菌繁殖，魚肉中的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生氨類物質(zhì)，導(dǎo)致pH值上升。結(jié)合感官評定(見表3)，單獨(dú)接種L.plantarumY12的魚汁pH值降低，但沒有造成魚汁不良感官變化，該結(jié)論和Fall等[23]的研究相似。

圖3 8 ℃下滅菌魚汁中pH值隨時(shí)間的變化Fig.3 pH evolution in sterilized fish juice at 8 ℃

根據(jù)圖4，第2天和第3天的混合培養(yǎng)的魚汁中由于L.plantarumY12產(chǎn)生有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)，ω(TVBN)分別為(10.36±1.00)mg/100 g和(10.79±1.61)mg/100 g；Pseudomonasspp.單獨(dú)培養(yǎng)魚汁中，第2天和第3天的ω(TVBN)分別為(15.33±0.00)mg/100 g和(17.03±0.40)mg/100 g，均顯著高于混合培養(yǎng)組(p<0.05)。第5天，Pseudomonasspp.組ω(TVBN)為(29.09±0.60)mg/100 g，和國家鮮肉標(biāo)準(zhǔn)30mg/100 g沒有顯著差異(p>0.05)；混合培養(yǎng)組ω(TVBN)為(24.55±1.00)mg/100 g，顯著低于國家鮮肉標(biāo)準(zhǔn)30 mg/100 g(p<0.05)。唐文靜等[24]在對冷藏海鱸魚魚塊的保鮮實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠明顯抑制鱸魚塊中腐敗菌的生長，降低了TVBN含量，和本文結(jié)果相似。根據(jù)圖3和圖4，魚汁在保藏過程中，和腐敗菌單獨(dú)培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)的pH值降低，TVBN含量增加較慢，可能由于pH值的降低抑制了Pseudomonasspp.的生長繁殖，從而降低了腐敗程度。

圖4 8 ℃下魚汁中TVBN值隨時(shí)間的變化Fig.4 Changes of TVBN in sterilized fish juice at 8 ℃

將L.plantarumY12及Pseudomonasspp.接種于滅菌魚汁，進(jìn)行感官評定，結(jié)果見表3。在保存過程中，對照組魚汁在6 d保藏過程中魚腥味都非常明顯，但是隨著時(shí)間的延長魚汁的味道變淡；和對照組不同的是，接種Y12的魚汁會有酸味，結(jié)合圖3，魚汁的pH值有一定下降，可能是由于L.plantarumY12產(chǎn)酸造成這種酸味，這種酸度是被評價(jià)人員接受的。接種Pseudomonasspp.的魚汁在第1天時(shí)魚腥味和對照沒有區(qū)別，第2天開始魚腥味仍然明顯，但是從第3天開始，魚汁逐漸產(chǎn)生讓人無法接受的臭味，在保藏的最后一天，味道刺鼻已經(jīng)無法進(jìn)行感官評定；混合培養(yǎng)的魚汁在前3 d感官評價(jià)分?jǐn)?shù)較高，異味不明顯，第4天時(shí)候才出現(xiàn)異味，原因可能是后期腐敗菌生長，L.plantarumY12抑制能力逐漸減弱，感官評價(jià)分?jǐn)?shù)也隨之降低。

表3 滅菌魚汁在8 ℃條件下保藏6 d的感官評價(jià)結(jié)果

2.5 乳酸菌對新鮮魚肉保鮮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別制備4組新鮮的黃花魚塊，其中1組浸漬于生理鹽水中，L.plantarumY12組使用濃度為107CFU/mL菌懸液浸漬10 min，Pseudomonasspp.組噴涂濃度為105CFU/mL的Pseudomonasspp.菌懸液，混合培養(yǎng)組使用L.plantarumY12浸漬后噴涂Pseudomonasspp.菌懸液。各組魚塊在8 ℃下保藏，保藏期內(nèi)TVBN值的變化如圖5。

圖5 8 ℃下魚塊中TVBN值隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes of TVBN in fresh fish meat with different storage time at 8 ℃

在整個(gè)保藏過程中，各組魚塊中TVBN含量隨著時(shí)間的延長逐漸增加(p<0.05)。與Pseudomonasspp.單獨(dú)接種和混合接種的魚肉相比，未接菌和L.plantarumY12接種的魚肉的TVBN值增加緩慢；第3天時(shí)，未接菌對照組以及接種L.plantarumY12魚肉中，ω(TVBN)分別為(12.43±0.25) mg/100 g和(12.00±0.74)mg/100 g，沒有顯著性差異(p>0.05)；Pseudomonasspp.和混合培養(yǎng)的魚肉中ω(TVBN)分別為(22.75 ±2.47)mg/100 g和(17.85±0.49)mg /100 g，都超過國家二級鮮肉標(biāo)準(zhǔn)的TVBN限值，混合培養(yǎng)的魚肉中TVBN值低于Pseudomonasspp.單獨(dú)接種魚肉中TVBN值(p<0.05)，說明乳酸菌能夠抑制腐敗菌的生長，起到延緩魚肉腐敗的作用。第6天，未接菌對照組ω(TVBN)為(34.65±3.21)mg/100 g，顯著高于國家標(biāo)準(zhǔn)30 mg/100 g(p<0.05)；而接種L.plantarumY12的魚塊樣品ω(TVBN)是(29.00±1.24)mg/100 g，未超過國家標(biāo)準(zhǔn)；混合培養(yǎng)組(37.45±1.48)mg/100 g，Pseudomonasspp.單獨(dú)培養(yǎng)達(dá)(42.7±2.96)mg/100 g顯著高于(p<0.05)混合培養(yǎng)組，和滅菌魚汁的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，證明L.plantarumY12能夠有效抑制腐敗菌的生長，對黃花魚塊達(dá)到一定的保鮮作用。

感官評定是判斷魚體是否腐敗的一個(gè)重要的指標(biāo)，達(dá)到感官拒絕的水產(chǎn)品不會被消費(fèi)者所接受[25]。新鮮黃花魚肉保藏6 d的感官評價(jià)結(jié)果如表4。第2天，4組魚肉的感官上沒有較大的變化。從第4天開始，4組魚肉在感官上發(fā)生變化，其中Pseudomonasspp.單獨(dú)培養(yǎng)的魚肉已經(jīng)達(dá)到了感官拒絕點(diǎn)，魚肉具有氨臭味，失去魚肉本身的彈性；混合培養(yǎng)組，略微有一點(diǎn)氨臭味，不如對照以及單獨(dú)接種L.plantarumY12的黃花魚肉感官評價(jià)結(jié)果高。第6天，4組魚肉都達(dá)到感官拒絕點(diǎn)，不能被人感官接受，其中從形態(tài)以及魚肉彈性看，單獨(dú)接種L.plantarumY12的黃花魚肉及混合培養(yǎng)黃花魚肉要好于Pseudomonasspp.單獨(dú)培養(yǎng)的魚肉。對照組魚肉中天然存在的微生物是造成對照組魚肉腐敗變質(zhì)的原因，從而使對照組魚肉在保藏第6天TVBN含量超過國家標(biāo)準(zhǔn)，而單獨(dú)接種L.plantarumY12的黃花魚肉中L.plantarumY12抑制了天然存在的微生物生長，從而起到保鮮的作用。

乳酸菌在應(yīng)用于食品保鮮時(shí)，需要考慮其致腐性以及在實(shí)際條件下的保鮮效果。L.plantarumY12對Pseudomonasspp.具有抑制作用，并且在保藏過程中會降低魚汁和魚肉的pH值。Fall等[23]研究發(fā)現(xiàn)L.piscium能夠降低熱帶去皮蝦保藏過程中pH值，抑制熱帶去皮蝦熱死環(huán)絲菌的生長，混合培養(yǎng)的蝦感官評分始終高于腐敗菌單獨(dú)培養(yǎng)，但是這種pH值的降低效果并沒有影響人對蝦的感官評價(jià)，這個(gè)結(jié)果也和本研究的感官評價(jià)結(jié)果一致。Saraoui等[3]用菌株Lactococcuspiscium處理水煮去皮熱帶蝦可以有效降低去皮蝦在一定保藏時(shí)間內(nèi)TVBN含量并保持蝦的良好感官狀態(tài)。L.plantarumY12和Pseudomonasspp.共培養(yǎng)時(shí)，TVBN含量明顯下降，說明抑制作用顯著。乳酸菌和乳酸菌的代謝產(chǎn)物作為生物保鮮中一種重要的天然保鮮劑，能夠明顯提高食品的質(zhì)量。

表4 新鮮魚肉在8 ℃條件下保藏6 d的感官評價(jià)結(jié)果

3 結(jié) 論

文中海洋魚類來源的L.plantarumY12能夠抑制有害菌生長，在保藏過程中也不會使魚肉或魚汁腐敗，在一定保藏條件下可以延緩有害微生物引起的魚肉腐敗。L.plantarumY12應(yīng)用于黃花魚肉保鮮的劑量以及保鮮的溫度范圍還有待進(jìn)一步研究。