時(shí) 月， 王宇濱， 李 武， 馬 越， 趙曉燕， 張 超

(北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心/果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100097)

西瓜(Citrulluslanatus)是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，近十年來，我國西瓜生產(chǎn)總量一直居世界首位，2015年全國西瓜播種面積186.07萬公頃，總產(chǎn)量7 714.0萬t，占全球總產(chǎn)量的66.2%，經(jīng)濟(jì)效益顯著[1-2]。目前，西瓜主要被鮮食，小部分被加工成為鮮切西瓜、西瓜汁、西瓜粉或西瓜酒等。在加工過程中，約占西瓜質(zhì)量30%的西瓜皮作為副產(chǎn)物被拋棄。研究顯示西瓜皮具有很高的利用價(jià)值，其已經(jīng)在提取果膠、加工果醬果脯、飼料以及藥用等方面得到應(yīng)用[3-4]。

葉綠素是天然的綠色色素來源，具有純天然和色價(jià)高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥領(lǐng)域。目前，葉綠素的生產(chǎn)原料主要是蠶沙和菠菜，其中蠶沙中葉綠素含量在5～10 mg/(g干重)[5]，菠菜中葉綠素含量在0.524 mg/(g干重)[6]。葉綠素的提取方法包括溶劑提取法[7]、超聲波輔助溶劑提取法[8]、微波輔助溶劑提取法[9]、酶處理輔助溶劑提取法等[10]，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。近年來，超高壓輔助溶劑提取法已經(jīng)應(yīng)用于藍(lán)莓渣花色苷[11]、橙皮果膠[12]、人參的人參皂甙[13]、綠茶茶多酚[14]、龍眼和赤松根抗氧化物質(zhì)[15-16]的提取，有效地提高了目標(biāo)組分的產(chǎn)率。但是，使用超高壓輔助溶劑提取法提取西瓜皮中葉綠素的研究還鮮有報(bào)道。

因此，本文分別采用溶劑提取法和超高壓輔助溶劑提取法兩種方法對西瓜皮中葉綠素進(jìn)行提取，優(yōu)化其工藝參數(shù)，比較其葉綠素提取率，以期為西瓜副產(chǎn)物綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西瓜，京欣3號，購于北京果香四溢蔬菜水果超市(曙光花園店)；丙酮和乙醇，均為分析純。

果蔬削皮機(jī)，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心研制；FW100型萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；W201型恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司；MV-1800型分光光度儀，日本島津儀器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BDS200FL型超高壓設(shè)備，英國STANSTED(SFP)公司；HP200型熱泵干燥箱，中國科學(xué)院理化研究所研制。

1.2 西瓜皮粉末的制備

使用果蔬削皮機(jī)為西瓜削皮，果皮厚度約1.0 mm，將西瓜皮在60 ℃條件下干燥3～4 h，使用粉碎機(jī)粉碎至30目，獲得西瓜皮粉末。

1.3 溶劑提取法單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以西瓜皮粉末為原料，研究溶劑提取法的不同參數(shù)對葉綠素提取產(chǎn)率的影響。以葉綠素提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，對溶劑提取法的提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行考察，確定較佳實(shí)驗(yàn)范圍。

1.4 超高壓輔助溶劑提取法單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照溶劑提取法的較佳工藝參數(shù)進(jìn)行超高壓輔助溶劑提取法的提取，取一定量的西瓜皮粉和提取溶劑，排除空氣，真空密封在耐高壓聚乙烯袋中，研究超高壓處理對西瓜皮葉綠素提取率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)以葉綠素提取率為考察指標(biāo)，對超高壓處理時(shí)間、超高壓處理壓強(qiáng)、加壓次數(shù)進(jìn)行了考察。

1.5 葉綠素含量的測定

將1.3節(jié)和1.4節(jié)中的提取液過濾，獲得葉綠素提取液，分別測定在663和645 nm處的吸光度值，根據(jù)Arnon計(jì)算公式得到葉綠素總量ρT(mg/L)，見式(1)。

ρT=ρa(bǔ)+ρb=20.29A645+8.05A663。

(1)

再根據(jù)式(2)計(jì)算樣品中葉綠素含量，以每克西瓜皮粉干重中所含葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

(2)

其中ω，mg/g；ρT，mg/L；V，樣品提取液總體積，mL；m，西瓜皮粉質(zhì)量，g。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，采用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑對西瓜皮葉綠素提取率的影響

溶劑是決定溶劑提取法提取率高低的關(guān)鍵因素，參考前人的研究結(jié)果，選擇φ=95%乙醇、φ=80%丙酮、φ=47.5%乙醇和φ=40%丙酮混合液作為提取溶劑，在料液比1∶5 g/mL(即西瓜皮粉末質(zhì)量與提取溶劑體積的比例)，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h條件下，考察溶劑對西瓜皮葉綠素提取率的影響，結(jié)果見圖1。

不同小寫字母表示差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05，n=3)。圖1 溶劑對西瓜皮葉綠素提率的影響Fig.1 Effect of different solvents on yield of chlorophyll from watermelon peel

由圖1可知，φ=80%丙酮獲得葉綠素提取率顯著高于其他溶劑(p<0.05)。程紅艷等[17]研究顯示使用丙酮提取滸苔中葉綠素的提取率顯著高于乙醇提取，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)，使用φ=80%丙酮與丙酮和乙醇混合提取效果相差不大，這與唐小俊等[18]的研究結(jié)果一致。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇φ=80%丙酮作為提取溶劑。

2.2 料液比對西瓜皮葉綠素提取率的影響

用φ=80%丙酮作為提取溶劑，選取料液比分別為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 g/mL在60 ℃環(huán)境中提取2 h，考察料液比對西瓜皮葉綠素提取率的影響，結(jié)果見圖2。

不同小寫字母表示差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05，n=3)。圖2 料液比對西瓜皮葉綠素提取率的影響Fig.2 Effect of solvent ratio on yield of chlorophyll from watermelon peel

由圖2可知，隨著溶劑比的增大葉綠素提取率增大，當(dāng)料液比為1∶7 g/mL時(shí)，西瓜皮葉綠素提取率達(dá)到最大值，顯著高于其他料液比(p<0.05)；當(dāng)料液比繼續(xù)增大，葉綠素含量降低。料液比的大小影響著葉綠素的傳質(zhì)動力，料液比大，可能溶劑不能完全將西瓜皮中的葉綠素溶解，且料液比小，會產(chǎn)生溶劑浪費(fèi)，污染環(huán)境[19]。在提取荷葉中葉綠素的研究中，較佳料液比為1∶7 g/mL[20]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

2.3 提取溫度對西瓜皮葉綠素提取率的影響

用φ=80%丙酮作為提取溶劑，按照料液比1∶7 g/mL，選取提取溫度40、50、60、70 ℃提取2 h，考察提取溫度對西瓜皮葉綠素提取率的影響，結(jié)果見圖3。

不同小寫字母表示差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05，n=3)。圖3 提取溫度對西瓜皮葉綠素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of chlorophyll from watermelon peel

由圖3可知，提取溫度40和50 ℃獲得的葉綠素提取率顯著高于其他溫度(p<0.05)。該結(jié)果可能是由于葉綠素在高溫條件發(fā)生氧化，從而降低了提取率[21]。因此40～50 ℃為較適宜提取溫度。

2.4 提取時(shí)間對西瓜皮葉綠素提取率的影響

用φ=80%丙酮作為提取溶劑，按照料液比1∶7 g/mL的比例在50 ℃環(huán)境中提取，選取提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h，考察提取時(shí)間對西瓜皮葉綠素提取率的影響，結(jié)果見圖4。

不同小寫字母表示差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05，n=3)。圖4 提取時(shí)間對西瓜皮葉綠素提量的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of chlorophyll from watermelon peel

由圖4可知，西瓜皮的葉綠素提取率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，葉綠素提取率達(dá)到最高值，為3.92 mg/g，顯著高于其他提取時(shí)間(p<0.05)。該現(xiàn)象的原因可能在于隨著提取時(shí)間增加，葉綠素發(fā)生降解反應(yīng)，與陳紹瑗等[22]在桑葉葉綠素提取工藝優(yōu)化中葉綠素含量隨提取時(shí)間的變化趨勢一致。

綜上所述，溶劑提取法得到的較優(yōu)條件是以φ=80%的丙酮作為提取劑，在提取溫度為50 ℃，料液比為1∶7 g/mL的條件下，提取1.5 h，此時(shí)葉綠素提取率為3.92 mg/g。

2.5 超高壓時(shí)間和壓強(qiáng)對西瓜皮葉綠素提取率的影響

超高壓輔助溶劑提取法選擇與溶劑提取法相同的提取溶劑和料液比進(jìn)行提取，超高壓處理時(shí)間選擇100 MPa加壓1次，選取保壓時(shí)間為10、20、30 min；超高壓處理壓強(qiáng)選取20、40、60、80、100、200、300 MPa加壓1次，保壓時(shí)間為10 min，分別考察超高壓時(shí)間和壓強(qiáng)對西瓜皮葉綠素提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知，在保壓時(shí)間為30 min時(shí)，葉綠素提取率顯著低于10和20 min的葉綠素提取率(p<0.05)，而10和20 min葉綠素提取率差異不顯著(p>0.05)，葉綠素提取率最大為3.78 mg/g。

不同小寫字母表示差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05，n=3)。圖5 超高壓輔助溶劑提取法工藝參數(shù)對西瓜皮葉綠素提取率的影響Fig.5 Effects of ultra high pressure assisted solvent method parameters on yield of chlorophyll from watermelon peel

葉綠素提取率隨超高壓處理壓力的提高而降低，其中20～60 MPa獲得葉綠素提取率最高，顯著高于其他壓力；當(dāng)壓力為40 MPa時(shí)，獲得最高的葉綠素提取率，為4.46 mg/g。因此，在20～60 MPa的壓力下，即可促進(jìn)西瓜皮中的葉綠素溶出。于楊[23]運(yùn)用超高壓技術(shù)對蔥葉中的葉綠素進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著壓力增大，葉綠素提取率降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。張川等[24]研究發(fā)現(xiàn)貯藏壓力越高，韭菜的葉綠素含量下降越快。因此，在40 MPa壓力下維持10 min為超高壓輔助溶劑提取法的較佳工藝條件。

2.6 超高壓輔助提取加壓次數(shù)對西瓜皮葉綠素提取率的影響

選擇與溶劑提取法相同的提取溶劑和料液比進(jìn)行提取，選擇超高壓處理壓力為100 MPa，溫度為25 ℃，加壓次數(shù)為1、2和3次，每次的保壓時(shí)間為10 min，考察超高壓加壓次數(shù)對西瓜皮葉綠素提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著加壓次數(shù)的增多，葉綠素提取率降低，在提取第2次時(shí)，葉綠素的提取量顯著低于第1次的提取量。原因可能是在40 MPa，保壓10 min的條件下即可使西瓜皮中的葉綠素提取完全，當(dāng)加壓次數(shù)增多，保壓時(shí)間也隨之延長，部分葉綠損失，因而葉綠素提取率降低。

綜上所述，超高壓輔助溶劑提取得到的最優(yōu)條件是：以φ=80%的丙酮作為提取劑，在料液比為1∶7 g/mL溫度為25 ℃條件下，使用40 MPa加壓1次，保壓10 min，此時(shí)葉綠素提取率為4.46 mg/g。

不同小寫字母表示差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05，n=3)。圖6 超高壓輔助溶劑提取法加壓次數(shù)對西瓜皮葉綠素提量的影響Fig.6 Effect of numbers of ultra high pressure assisted solvent extraction method on yield of chlorophyll from watermelon peel

2.7 溶劑提取法與超高壓輔助溶劑提取法的比較

表1比較溶劑提取法和超高壓輔助溶劑提取法較優(yōu)工藝參數(shù)對葉綠素提取率的影響。

表1 溶劑提取法與超高壓輔助溶劑提取法的比較

由表1可知，超高壓輔助溶劑提取法在減少提取時(shí)間90%以上，降低提取溫度的前提下，提高葉綠素提取率11.7%。相關(guān)研究指出，超高壓輔助技術(shù)一方面可以通過影響溶劑性質(zhì)，從而影響提取效果；另一方面則是通過破壞被提取物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高滲透率，從而加快了傳質(zhì)速率[15]。

3 結(jié) 論

本文采用超高壓輔助溶劑提取法提取西瓜皮中葉綠素，并優(yōu)化該方法的工藝參數(shù)，最后與傳統(tǒng)的溶劑提取法提取效果進(jìn)行對比。結(jié)果顯示超高壓輔助溶劑提取法比傳統(tǒng)的溶劑提取法減少提取時(shí)間90%以上，提高葉綠素提取率11.7%。該結(jié)論為葉綠素的提取提供新思路，為西瓜副產(chǎn)物的綜合利用提供技術(shù)手段，具有重要的實(shí)踐意義。下一步可以對兩種提取方法獲得葉綠素的色價(jià)和功能性等方面進(jìn)行比較。