外源性果膠甲酯酶對低鹽腌漬黃瓜質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響

李 曉， 王文亮， 王月明， 崔文甲,*， 劉麗娜， 徐志祥

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部新食資源加工重點實驗室， 山東 濟(jì)南 250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 泰安 271018)

黃瓜因其質(zhì)地脆嫩、風(fēng)味清香、可直接生食等特點深受消費者的喜愛[1]。長期或過量食用高鹽腌漬黃瓜，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康，低鹽腌漬與高鹽腌漬相比更加營養(yǎng)健康。一般認(rèn)為腌漬蔬菜含鹽量低于8%為低鹽含量[2]，低鹽腌漬由于含鹽量不足，導(dǎo)致黃瓜品質(zhì)下降，失去黃瓜原有的口感與風(fēng)味。有些學(xué)者利用一種或幾種金屬離子進(jìn)行腌漬菜的保脆，在一定程度上起到了作用[3-6]。

果蔬硬度主要受果蔬中果膠物質(zhì)的影響[7]。果膠甲酯酶對果膠具有去甲酯化作用[8]，果膠按照酯化度分為高甲氧基果膠(HM, 基本與Ca2+不發(fā)生反應(yīng))和低甲氧基果膠(LM, 能與Ca2+形成凝膠)，果膠甲酯酶可將高甲氧基果膠轉(zhuǎn)化成低甲氧基果膠[9]，低甲氧基果膠與Ca2+發(fā)生交聯(lián)作用，得到Ca2+凝膠，形成一個堅固的果膠酸鈣網(wǎng)絡(luò)，防止果膠物質(zhì)溶出，從而提高果蔬的品質(zhì)[10-11]。Ando等[12]也證實了這一結(jié)論。有研究發(fā)現(xiàn)，甜橙果實中果膠甲酯酶(PG)活性增加，導(dǎo)致果實軟化程度降低[13]；杜小琴等[14-16]發(fā)現(xiàn)低溫漂燙激活蘿卜中果膠甲酯酶，蘿卜泡菜的脆度得到了提高；陸勝民等[17]發(fā)現(xiàn)梅果實軟化過程中多聚半乳糖醛酸酶含量上升、活性增強(qiáng)；楊林等[18]探討了果膠甲酯酶和外源Ca2+對番茄丁硬度的影響，實驗表明果膠甲酯酶結(jié)合氯化鈣對番茄丁硬化效果明顯；Anthon等[19]也發(fā)現(xiàn)了果膠甲酯酶在改善白蘿卜泡菜脆度方面具有良好效果。文章通過添加外源性果膠甲酯酶處理低鹽腌漬黃瓜達(dá)到保脆目的，為果膠甲酯酶改善低鹽腌漬蔬菜質(zhì)構(gòu)的應(yīng)用提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃瓜，市售；果膠甲酯酶(50 mL)，美國Sigma公司；食鹽(食品級)，山東肥城精制鹽廠；乳酸鈣(食品級)，山東優(yōu)索化工科技有限公司；硫酸(分析純)，萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；無水乙醇(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；咔唑(化學(xué)級)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；半乳糖醛酸(分析純)，北京Solarbio科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX- 9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SHZ- A型水浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TA.XT Plus型食品質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems公司；H.H.S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；UV- 6100型紫外可見光分光光度計，上海元析儀器有限公司；數(shù)顯攪拌器，德國IKA公司；離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品的制備

將新鮮的黃瓜清洗，切成規(guī)格為5 cm×1 cm×1 cm的塊狀，用電熱鼓風(fēng)干燥箱在40 ℃下烘干2 h，使黃瓜表面脫水。將制備好的黃瓜稱重160 g放入裝有質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%食鹽水的500 mL錐形瓶中進(jìn)行腌漬，料液比為1∶2，并放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，使培養(yǎng)箱中環(huán)境保持溫度15 ℃、濕度30%。

1.3.2全質(zhì)構(gòu)分析

以經(jīng)過不同處理的黃瓜為研究對象，利用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行全質(zhì)構(gòu)分析(TPA)檢測[20]。質(zhì)構(gòu)儀質(zhì)地多面分析方法是模擬人牙齒咀嚼食物，對試樣進(jìn)行2次壓縮的機(jī)械過程，即利用力學(xué)測試方法來模擬人的口腔運動[21]。該測定可綜合評價食品的質(zhì)地特性，減少了感官評價中主觀因素帶來的評價誤差。采用P5平底圓柱探頭，觸發(fā)力5 N，測前速度1mm/s，測中速度0.5 mm/s，測后速度1 mm/s，試樣壓縮形變50%，2次壓縮停頓3 s，隨機(jī)取5個樣品進(jìn)行測試，取平均值。

1.3.3單因素實驗設(shè)計

實驗考察乳酸鈣添加量、果膠甲酯酶添加量、果膠甲酯酶作用溫度及作用時間對低鹽腌漬黃瓜硬度的影響。

1.3.3.1 乳酸鈣添加量的測定

保持溫度50 ℃，果膠甲酯酶添加量為0.60%不變，處理時間為20 min。實驗設(shè)定7個乳酸鈣添加量0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 g/mL，測定腌漬黃瓜硬度以確定乳酸鈣添加量的合適范圍。

1.3.3.2 果膠甲酯酶添加量的測定

保持溫度50 ℃，乳酸鈣添加量為0.40 g/mL不變，處理時間為20 min。實驗設(shè)定5個果膠甲酯酶添加量(體積分?jǐn)?shù))0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%，測定腌漬黃瓜硬度以確定果膠甲酯酶添加量的合適范圍。

1.3.3.3 果膠甲酯酶作用溫度的測定

保持果膠甲酯酶添加量為0.60%，乳酸鈣添加量為0.40 g/mL不變，處理時間為20 min。實驗設(shè)定5個果膠甲酯酶作用溫度20、30、40、50、60 ℃，測定腌漬黃瓜硬度以確定果膠甲酯酶作用溫度的合適范圍。

1.3.3.4 果膠甲酯酶作用時間的測定

保持果膠甲酯酶添加量為0.60%，乳酸鈣添加量為0.40 g/mL不變，處理溫度為50 ℃。實驗設(shè)定5個果膠甲酯酶作用時間10、20、30、40、50 min，測定腌漬黃瓜硬度以確定果膠甲酯酶作用時間的合適范圍。

1.3.4正交試驗設(shè)計

以不同乳酸鈣添加量、果膠甲酯酶添加量、果膠甲酯酶作用溫度和作用時間為考察因素，黃瓜全質(zhì)構(gòu)分析為主要指標(biāo)，采用四因素三水平正交試驗確定外源性果膠甲酯酶優(yōu)化作用條件，因素水平見表1。

表1 果膠甲酯酶優(yōu)化作用條件正交試驗因素水平表

1.3.5黃瓜中果膠含量的測定

采用咔唑比色法測定[22]。將用酶處理好的黃瓜取出后放入干燥錐形瓶中，在80 ℃殺菌20 min，待樣品冷卻后，測定其質(zhì)構(gòu)和果膠含量。用無水乙醇沉淀試樣中的果膠，果膠經(jīng)水解后生成半乳糖醛酸，在硫酸中與咔唑試劑發(fā)生縮合反應(yīng)，生成紫紅色化合物，該化合物在525 nm處有最大吸收，其吸收值與果膠含量成正比，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配置半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)使用液，質(zhì)量濃度為0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 mg/L，用分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)使用液的吸光度，制成半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，R2=0.997 8，線性關(guān)系良好，數(shù)據(jù)可用。

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of galacturonic acid

1.3.6數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)處理與分析都用SPSS進(jìn)行鄧肯分析，p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鈣添加比例的確定

低鹽黃瓜的硬度隨著乳酸鈣添加量的增大而先增大后減小，見圖2。在乳酸鈣添加量達(dá)到0.40g/mL時，低鹽黃瓜的硬度最大，達(dá)到2 760 g左右；后繼續(xù)增加乳酸鈣添加量，低鹽黃瓜硬度有下降的趨勢。因此從節(jié)約成本的角度考慮，乳酸鈣的較優(yōu)添加量為0.40 g/mL。

圖2 乳酸鈣添加量對低鹽黃瓜硬度的影響Fig.2 Effect of calcium lactate amounts on hardness of low-salt cucumber

2.2 果膠甲酯酶添加比例的確定

隨著果膠甲酯酶添加比例的增大，低鹽黃瓜的硬度先增大后減小(見圖3)。在果膠甲酯酶添加比例為0.60%時，低鹽黃瓜的硬度顯著地增大，以后隨果膠甲酯酶添加比例的增大而沒有明顯的變化；當(dāng)添加量大于0.80%時，黃瓜硬度明顯下降。其中不添加果膠甲酯酶時，低鹽黃瓜硬度為2 400 g左右，添加果膠甲酯酶的低鹽黃瓜硬度明顯高于未添加果膠甲酯酶的低鹽黃瓜。在果膠甲酯酶添加比例為0.60%時，低鹽黃瓜硬度最大為3 000 g左右。由此可知，在添加0.60%果膠甲酯酶時，低鹽黃瓜硬化效果較優(yōu)。

圖3 果膠甲酯酶添加量對低鹽黃瓜硬度的影響Fig.3 Effect of different additions of pectin methylesterase on hardness of low-salt cucumber

2.3 果膠甲酯酶作用溫度的確定

隨著果膠甲酯酶作用溫度的升高低鹽黃瓜的硬度先增大后減小，見圖4。在果膠甲酯酶作用溫度為40～50 ℃時，低鹽黃瓜的硬度顯著地增大；當(dāng)酶作用溫度為50 ℃時，低鹽黃瓜的硬度最大達(dá)到3 450 g左右；以后隨果膠甲酯酶作用溫度的升高而明顯下降，當(dāng)作用溫度達(dá)到60 ℃時，黃瓜硬度下降到最低點。樂毅等[23]同樣也證明了，當(dāng)作用溫度超過50 ℃時，果膠甲酯酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，導(dǎo)致酶變性。宗迪等[24]證明了果膠甲酯酶在85 ℃時即可以失活，溫度過高，果膠甲酯酶的活性受到抑制，低鹽黃瓜硬度下降。由此可知，在果膠甲酯酶作用溫度為50 ℃時，低鹽黃瓜保脆效果較優(yōu)。

圖4 果膠甲酯酶作用溫度對低鹽黃瓜硬度的影響Fig.4 Effect of different enzymatic temperatures of pectin methylesterase on hardness of low-salt cucumber

2.4 果膠甲酯酶作用時間的確定

隨著果膠甲酯酶作用時間的延長低鹽黃瓜的硬度呈現(xiàn)出下降的趨勢，見圖5。果膠甲酯酶作用時間為10～20 min時，低鹽黃瓜的硬度顯著地增大；當(dāng)作用時間為20 min時，低鹽黃瓜硬度達(dá)到3 300 g左右；當(dāng)酶作用時間為20～50 min時，低鹽黃瓜的硬度隨作用時間的延長持續(xù)下降；當(dāng)作用時間達(dá)到50 min時，黃瓜硬度下降到最低點，硬度僅2 300 g左右。長時間酶的作用，會導(dǎo)致黃瓜內(nèi)的果膠物質(zhì)被分解，果膠含量與黃瓜的硬度呈正相關(guān)。由此可知，在果膠甲酯酶作用時間為20 min時，低鹽黃瓜脆度較優(yōu)。

圖5 果膠甲酯酶作用時間對低鹽黃瓜硬度的影響Fig.5 Effect of different enzymatic time of pectin methylesterase on hardness of low-salt cucumber

2.5 外源性果膠甲酯酶優(yōu)化作用條件正交試驗結(jié)果

極差R由大到小的順序為B、D、A、C，也就是說，對于外源性果膠甲酯酶保脆的工藝，果膠甲酯酶添加量的影響最大，其次是酶作用時間、乳酸鈣添加量、酶作用溫度(見表2)。結(jié)果表明，組合A2B1C2D2為最佳組合，即乳酸鈣添加量0.40 g/mL、酶添加量0.40%、酶作用溫度50 ℃、酶作用時間20 min。通過驗證實驗對A2B1C2D2進(jìn)行TPA質(zhì)構(gòu)測定，硬度為3 123.441 g，說明A2B1C2D2為低鹽黃瓜添加外源性果膠甲酯酶的較優(yōu)作用條件。

表2 果膠甲酯酶優(yōu)化作用條件正交試驗結(jié)果

2.6 外源性果膠甲酯酶對低鹽腌漬黃瓜質(zhì)地的影響

果膠含量的多少，直接影響了果蔬的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)[25]。對按正交試驗所得的添加外源性果膠甲酯酶優(yōu)化作用條件處理后的和未添加外源性果膠甲酯酶的低鹽腌漬黃瓜分別進(jìn)行質(zhì)構(gòu)和果膠含量的測定，探究果膠甲酯酶的添加對低鹽腌漬黃瓜硬度、咀嚼度和果膠含量的影響。

2.6.1外源性果膠甲酯酶對低鹽腌漬黃瓜質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響

經(jīng)過酶處理的低鹽腌漬黃瓜與未經(jīng)酶處理的低鹽腌漬黃瓜在硬度和咀嚼度上的對比結(jié)果見圖6。從圖6可以看出：初始黃瓜樣品的硬度較高，為3 349.767 g，具有較好的脆度。將經(jīng)過酶處理和未經(jīng)酶處理的黃瓜樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過酶處理的低鹽腌漬黃瓜樣品在硬度上略高于未經(jīng)過酶處理的樣品，分別為2 502.028、2 393.135 g，差值為108.893 g。初始黃瓜樣品的咀嚼度較高，為232.879 g，具有較好的咀嚼度。將經(jīng)過酶處理和未經(jīng)酶處理的黃瓜樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過酶處理的低鹽腌漬黃瓜樣品在咀嚼度上也略高于未經(jīng)過酶處理的樣品，分別為232.314、231.047 g，差值為1.294 g。通過數(shù)據(jù)分析，添加果膠甲酯酶的樣品能更好地維持黃瓜的硬度，證明了果膠甲酯酶與Ca2+發(fā)生交聯(lián)作用，形成的果膠酸鈣網(wǎng)絡(luò)能夠使得低鹽腌漬黃瓜保持其硬度。添加果膠甲酯酶同樣也能更好地維持黃瓜的咀嚼度，保持了低鹽腌漬黃瓜的口感，通過對添加和未添加果膠甲酯酶的低鹽腌漬黃瓜硬度、咀嚼度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酶處理在維持低鹽腌漬黃瓜硬度、咀嚼度上起到了較好的效果，果膠甲酯酶在低鹽腌漬工藝中的保脆護(hù)脆方面發(fā)揮了重要作用。

圖6 不同處理方式樣品的硬度和咀嚼度Fig.6 Hardness and chewiness of samples treated by different processing methods

2.6.2外源性果膠甲酯酶對低鹽腌漬黃瓜果膠含量的影響

圖7 不同處理方式樣品的果膠含量Fig.7 Pectin contents of samples treated by different processing methods

不同處理方式樣品的果膠含量測定結(jié)果見圖7。初始黃瓜樣品中的果膠質(zhì)量比為1.318 g/kg，經(jīng)過酶處理的黃瓜樣品的果膠質(zhì)量比低于初始黃瓜，為1.284 g/kg，未經(jīng)過果膠甲酯酶處理的樣品，果膠含量僅有0.824 g/kg。外源性果膠甲酯酶的添加，一定程度上彌補(bǔ)了腌制過程中，Na+置換原果膠中的Mg2+和Ca2+，使得原果膠含量下降，硬度下降。梅明鑫等[25]、陳光靜等[26]分別對腌制蘿卜和腌制大葉麻竹筍進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)果蔬經(jīng)過腌制處理后，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞壁和中膠層變得收縮、塌陷，進(jìn)一步驗證了這一結(jié)論。同時，添加外源性果膠甲酯酶而形成的果膠金屬橋，使得蔬菜組織變得更脆嫩[12]，更好的維持了低鹽腌漬黃瓜的口感，并與圖6中TPA測試結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

通過單因素實驗、正交試驗結(jié)合全質(zhì)構(gòu)分析測試，確定并優(yōu)化了低鹽腌漬黃瓜添加外源性果膠甲酯酶作用條件，即乳酸鈣添加量0.40 g/mL、酶添加量0.4%、酶作用溫度50 ℃、酶作用時間20 min；研究了優(yōu)化條件下添加外源性果膠甲酯酶對低鹽腌漬黃瓜果膠含量和質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過果膠甲酯酶作用的低鹽腌漬黃瓜樣品在硬度、咀嚼度和果膠質(zhì)量比上分別高出未添加果膠甲酯酶的低鹽腌漬黃瓜樣品108.893 g、1.294 g、0.460 g/kg，添加果膠甲酯酶改善了低鹽腌漬黃瓜的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)。