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(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所,浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310021)

雪菜,又名雪里蕻(Brassicajunceavar. crispifolia),屬十字花科蕓薹屬,是芥菜的變種,也稱為葉用芥菜[1],在我國(guó)南北各地均有種植,尤其在江浙一帶廣為栽培。雪菜經(jīng)腌制后,香氣四溢,滋味鮮美,是腌漬蔬菜中最受歡迎的產(chǎn)品之一。

我國(guó)的漬菜腌制是依靠傳統(tǒng)的食鹽高滲透壓進(jìn)行,含鹽量高達(dá)13%～15%。當(dāng)前我國(guó)對(duì)腌漬菜低鹽化尚無(wú)統(tǒng)一的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。例如,我國(guó)第一個(gè)低鹽泡菜地方標(biāo)準(zhǔn)“四川泡菜”規(guī)定泡菜的食鹽含量≤4%,而榨菜行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的低鹽榨菜標(biāo)準(zhǔn)含鹽量≤7%[2],低鹽發(fā)酵辣椒食鹽含量≤8%[3]。在漬菜腌制過(guò)程中,調(diào)節(jié)鹽分含量可達(dá)到調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化及風(fēng)味形成的目的[4-5]。腌制時(shí),由于食鹽產(chǎn)生滲透、擴(kuò)散和吸收等物理現(xiàn)象而造成了原輔料之間的成分置換,同時(shí)借助微生物的發(fā)酵作用所產(chǎn)生的一系列生化學(xué)變化形成了腌制蔬菜特定的風(fēng)味[6-7]。評(píng)價(jià)腌制蔬菜品質(zhì)的指標(biāo)有色澤形態(tài)、香氣、質(zhì)地、滋味等,一般認(rèn)為優(yōu)質(zhì)腌制雪菜具有特有的香氣,色黃、味鮮、有脆性[8]。

在企業(yè)生產(chǎn)加工中,由于生產(chǎn)周期的需要,雪菜采用高鹽保存,包括目前的低鹽產(chǎn)品也是高鹽坯料經(jīng)脫鹽加工而成的。高鹽可以使雪菜得以較長(zhǎng)時(shí)間的保存,但是高鹽容易產(chǎn)生高化學(xué)需氧量的鹵水排放,導(dǎo)致河水及農(nóng)田受到嚴(yán)重污染[9-10]。另外,高鹽雪菜在加工過(guò)程中需要脫鹽脫水等環(huán)節(jié)而導(dǎo)致加工工藝耗工費(fèi)時(shí)、成本增加、風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量流失等,且高鹽在腌制時(shí)亞硝酸鹽生成較慢,亞硝峰出現(xiàn)晚,峰值高[11]。因此腌制蔬菜的低鹽化處理越來(lái)越受到人們的青睞。但若僅依靠低鹽,其最直接的結(jié)果是降低了滲透壓對(duì)有害微生物的抑制作用,使雪菜易受有害微生物的侵染,影響了雪菜發(fā)酵過(guò)程中微生物的群落結(jié)構(gòu)[12],將直接或間接地影響雪菜的風(fēng)味和品質(zhì)。

因此,本研究為了降低雪菜腌制過(guò)程中的用鹽量,改變傳統(tǒng)漬菜腌制坯料長(zhǎng)久不變的高鹽保存模式,以CO2或N2厭氧條件下的低鹽雪菜以及傳統(tǒng)的高鹽雪菜為研究對(duì)象,分析了厭氧環(huán)境下雪菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),結(jié)果可為厭氧條件長(zhǎng)效保存與發(fā)酵提供指導(dǎo),為改善我國(guó)傳統(tǒng)腌制蔬菜的工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪菜(Brassicajunceavar. multiceps)、食鹽(食用級(jí)) 市售;CO2、N2純度99.995%,杭州今工特種氣體有限公司。

固相微萃取器手柄、SPME裝置、65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB)萃取頭 美國(guó)Supelco公司;Trace DSQ GC-MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Finnigan質(zhì)譜公司;透明EVOH包裝材料(透氧率為1.2 g/m2/d) 江蘇省昆山市華億塑料有限公司;CYES-Ⅱ型氧、二氧化碳?xì)怏w測(cè)定儀 上海精勝科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同鹽量低鹽雪菜腌制 以雪菜作為原料,在腌制池中進(jìn)行腌制。采用傳統(tǒng)腌制方法,即一層菜體一層鹽,用鹽總量分別為7%(低鹽)、14%(高鹽),壓實(shí)雪菜,最上層用重石壓實(shí),保存3個(gè)月。

1.2.2 厭氧條件下低鹽雪菜腌制 選用一端開(kāi)口的EVOH薄膜袋套在腌制容器中,開(kāi)口的下沿部位打孔后安裝充排氣開(kāi)關(guān),雪菜按照1.2.1的方法鹽腌制。采用CO2或N2氣體調(diào)節(jié)厭氧環(huán)境,先用真空泵抽出EVOH薄膜袋中的空氣并充入CO2或N2氣體,并反復(fù)若干次直至袋中的壓力達(dá)到0.06 MPa,袋中CO2或N2氣體濃度達(dá)95%～98%時(shí)止。采用二氧化碳?xì)怏w測(cè)定儀進(jìn)行監(jiān)測(cè),當(dāng)氣體濃度不足時(shí),充入氣體并達(dá)到濃度要求。

1.2.3 HS-SPME-GC/MS分析腌制雪菜中的揮發(fā)性組分 采用頂空固相微萃取法(headspace solid-phase micro-extraction,HS-SPME)。取腌制3個(gè)月的不同部位各2 g,混合于10 mL的萃取瓶中,插入經(jīng)老化的萃取頭(DVB/CAR/PDMS,50/30 μm),于60 ℃水浴條件頂空下萃取30 min后氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gaschromatography-mass spectrometer,GC-MS)進(jìn)樣,解析時(shí)間為5 min。

色譜條件:石英毛細(xì)管柱,CP-Wax52CB(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升溫:40 ℃ 保持2 min,以5 ℃/min升溫至100 ℃,保持2 min;再以10 ℃/min上升到250 ℃,進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣He,流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件:電離方式EI,電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃,傳輸線溫度250 ℃。掃描質(zhì)量范圍45～300 amu。

GC-MS試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Xcalibur 軟件處理,未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與 NIST譜庫(kù)和Wiley譜庫(kù)相匹配,只有當(dāng)正反匹配度均大于800(最大值為1000)的鑒定結(jié)果才予以確認(rèn)。按峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

雪菜中主要揮發(fā)性成分通過(guò)Excel 2013軟件進(jìn)行匯總處理后導(dǎo)入SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,根據(jù)各揮發(fā)性化合物種類的相對(duì)含量,采用CANOCO 4.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行PCA主成分分析,比較不同處理與雪菜揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧環(huán)境下低鹽雪菜揮發(fā)性成分的GC-MS鑒定

對(duì)厭氧環(huán)境下的4組雪菜進(jìn)行SPME-GC-MS分析,得到其總離子色譜圖,見(jiàn)圖1。

圖1 雪菜揮發(fā)性成分GC-MS總離子色譜圖 Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of potherb mustard(Brassica juncea var.)注:A:低鹽;B:高鹽;C:低鹽CO2厭氧;D:低鹽N2厭氧。

不同揮發(fā)性化合物出峰時(shí)間見(jiàn)圖1。由圖1可以看出,不同雪菜揮發(fā)性成分出峰時(shí)間和離子強(qiáng)度差異較大,表明不同樣品間揮發(fā)性化合物差異大?？傠x子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后所得的質(zhì)譜圖,按各峰的質(zhì)譜裂片與文獻(xiàn)核對(duì),采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及人工譜圖解析,經(jīng)綜合分析鑒定,不同雪菜中揮發(fā)性物質(zhì)種類及相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 雪菜中揮發(fā)性物質(zhì)SPME-GC-MS分析結(jié)果Table 1 SPME-GC-MS analysis results of volatile compounds

續(xù)表

由表1可知,從采用高鹽、低鹽、低鹽厭氧(CO2或N2)處理的4組雪菜中分別鑒定出46、40、46和44種揮發(fā)性化合物,峰面積之和分別占總離子流色譜峰面積的91.12%、79.29%和84.17%、88.09%。揮發(fā)性化合物包括酯類、醛類、醇類、酸類、烴類、酮類和其他雜環(huán)化合物,其共同構(gòu)成了雪菜的整體風(fēng)味。4組雪菜揮發(fā)性物質(zhì)分類如圖2。

圖2 厭氧環(huán)境對(duì)雪菜揮發(fā)性風(fēng)味種類含量的影響 Fig.2 Different classes of volatile compounds from (Brassica juncea var)based on Anaerobic Environment

2.2 厭氧環(huán)境對(duì)雪菜主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)酯類化學(xué)物的影響 由表1和圖2可知,分別采用低鹽、高鹽、厭氧低鹽(CO2或N2)處理的4組雪菜中,酯類物質(zhì)分別被檢出11、7、12和8個(gè),相對(duì)含量分別為44.97%、40.45%、37.00%和21.8%。由此可見(jiàn),采用低鹽量保存的雪菜酯類物質(zhì)相對(duì)含量最高,且采用低鹽量和低鹽量CO2厭氧保存的雪菜酯類物質(zhì)個(gè)數(shù)最多,而采用低鹽N2厭氧保存的雪菜酯類物質(zhì)相對(duì)含量最低,比低鹽組減少了23.17%,低鹽組與高鹽組兩者相差僅為4.52%。采用高鹽、低鹽和低鹽CO2厭氧3組處理的雪菜中異硫氰酸酯類化合物均檢出3個(gè),相對(duì)含量最高,分別為32.72%、32.97%、16.02%,分別占雪菜中酯類物質(zhì)的72.75%、81.50%和43.29%,為腌制雪菜的最主要揮發(fā)性物質(zhì)。

雪菜莖葉中存在次生代謝產(chǎn)物GS,根據(jù)其側(cè)鏈R基團(tuán)來(lái)源不同可以將GS分為脂肪族、芳香族和吲哚族3大類[13]。不同種類的GS在硫苷酶作用下產(chǎn)生異硫氰酸酯類(isothiocyanates,ITCs)、腈類(nitriles)、硫氰酸酯類(thiocyanates,TCs)、環(huán)腈類、惡唑烷酮類化合物等,GS也能在微生物的作用下有效降解[14]。GS與硫苷酶反應(yīng)需在有水存在的情況下進(jìn)行,其酶降解是復(fù)雜的多途徑降解反應(yīng)過(guò)程。雪菜腌制過(guò)程中,環(huán)境因子和條件(pH、溫度、時(shí)間)等因素共同決定了GS降解后產(chǎn)物的類型,依據(jù)主要降解產(chǎn)物可將其降解過(guò)程主要分為異硫氰酸酯、腈類與硫氰酸酯途徑等3個(gè)方面(見(jiàn)圖3)。異硫氰酸酯類(ITCs)為雪菜腌制過(guò)程中GS的主要酶解產(chǎn)物,雪菜在腌制的初期或早期,由于產(chǎn)生偏中性條件(pH5-8),硫苷酶水解GS生成的糖苷配基發(fā)生洛森重排反應(yīng)后形成ITCs,同時(shí)ITCs的生成受GS上R基團(tuán)影響,水解產(chǎn)生相應(yīng)的具有揮發(fā)性的ITCs[15]。從GS的降解途徑中可以解析為什么在雪菜揮發(fā)性物質(zhì)中檢測(cè)出吲哚以及部分腈類物質(zhì)。

圖3 硫苷酶解的主要降解產(chǎn)物[13]Fig.3 Main products of glucosinolates enzymatic degradation

近年來(lái),越來(lái)越多的研究認(rèn)為部分特定微生物也參與了GS的降解,如乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等[16]。早在20多年前,有學(xué)者就分離出了3種能降解GS的乳酸菌,并發(fā)現(xiàn)保加利亞乳酸桿菌能將GS分解成乳酸和異硫氰酸烯丙酯[17]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和乳酸乳球菌等乳酸菌能分解30%～33%的GS,并生成腈類物質(zhì)[16],表明乳酸菌在GS降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。采用低鹽N2厭氧保存的雪菜酯類物質(zhì)相對(duì)含量低而腈類物質(zhì)相對(duì)較高,可能是GS在N2的環(huán)境中其降解途徑是偏向于腈類;另一方面,由于無(wú)氧環(huán)境抑制了好氧微生物的生長(zhǎng)而有利于乳酸菌的生長(zhǎng),漬液pH較低鹽量組和高鹽量組低,也有利于向GS腈類物質(zhì)途徑降解(圖3)。

2.2.2 醛醇類化合物 醛醇類化合物一般是酯質(zhì)的降解產(chǎn)物,都具有香氣。由表1和圖2可知,分別采用低鹽、高鹽和低鹽厭氧處理(CO2或N2)的4組雪菜中,醛醇類化合物分別被檢出12、9、10和10個(gè),相對(duì)含量分別為19.2%、17.32%、18.44%和33.22%,采用低鹽N2厭氧處理的雪菜中醛醇類化合物較其他組均高。在檢出的醛醇類化合物中,苯甲醛、苯乙醇的在4組雪菜中含量均為最高,而苯甲醛等具有玫瑰花香、蜂蜜香,可能來(lái)源于雪菜乳酸菌對(duì)氨基酸的代謝[18]。

2.2.3 酸類化合物 發(fā)酵蔬菜中酸類物質(zhì)是乳酸菌發(fā)酵的主導(dǎo)產(chǎn)物[19-20],也是構(gòu)成發(fā)酵蔬菜特殊香味主體的物質(zhì)。4組雪菜中,低鹽、高鹽、低鹽厭氧組(CO2或N2)酸類物質(zhì)分別被檢出7、6、9和8個(gè),相對(duì)含量分別為7.62%、7.44%、15.88%和10.24%。十一烯酸、棕櫚酸、十三烷酸在4組雪菜中均檢出,肉豆蔻酸和2-丁烯二酸則均從兩組厭氧環(huán)境雪菜中檢出,且含量相對(duì)也較高,這可能和厭氧所形成的環(huán)境有關(guān)。

2.2.4 甲基硫化物類化合物 甲基含硫類化合物為腌制類蔬菜的特征類化合物,特別是以蘿卜和芥菜類為原料的腌制蔬菜制品。在腌制過(guò)程中,一些芥子苷被芥子苷酶分解成二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等硫醚化合物[21-22]。試驗(yàn)中檢測(cè)出2種含硫類化合物,即在腌制蘿卜中最常見(jiàn)的二甲基二硫和二甲基三硫,但是4組雪菜中其相對(duì)含量差異較大,分別為8.02%、0.7%、1.84%和0.83%。采用低鹽保存組,含硫類化合物相對(duì)含量最高,其他組相對(duì)較低,高鹽環(huán)境或者無(wú)氧環(huán)境抑制了微生物的繁殖及細(xì)胞破壞作用,減緩芥子苷的降解過(guò)程,從而使芥子苷降解產(chǎn)物在種類及相對(duì)含量上均比低鹽腌制產(chǎn)品少。

2.2.5 烷、烴及其雜環(huán)類化合物 烷烴及其雜環(huán)類化合物在4組雪菜揮發(fā)性物質(zhì)中相對(duì)含量分別為9.95%、12.2%、8.77%和12.94%,其中烯烴類化合物檢出較低,雜環(huán)類物質(zhì)主要為吡嗪、呋喃和萘等物質(zhì),其具有堅(jiān)果香等溫和的香味,雜環(huán)化合物的存在對(duì)泡菜整體風(fēng)味的形成具有協(xié)同作用[23]。

2.3 雪菜揮發(fā)性化合物種類差異性分析

以4組雪菜和10類揮發(fā)性成分的相對(duì)含量為數(shù)據(jù)源進(jìn)行差異性分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。圖中箭頭所處的象限表示影響因素與排序軸之間的正負(fù)相關(guān)性,箭頭連線的長(zhǎng)度代表著某個(gè)因子與研究對(duì)象分布相關(guān)程度的大小,連線越長(zhǎng),代表這個(gè)因子對(duì)研究對(duì)象的分布影響越大,箭頭連線與排序軸的夾角代表這某個(gè)因子與排序軸的相關(guān)性大小,夾角越小,相關(guān)性越高[24],即當(dāng)為銳角時(shí)表示兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系,鈍角時(shí)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。圖4中的PC1(82.3%)和PC2(12.5%)累計(jì)方差貢獻(xiàn)為94.8%,能夠反映樣本的大部分信息,因此選取前兩個(gè)主成分(PC1-PC2)進(jìn)行分析。由圖4可知,不同處理方式保存的雪菜樣本分別聚集在PCA得分圖的不同區(qū)域。采用低鹽組和高鹽組保存的雪菜樣本位于圖的左下象限,而且距離間隔較小,表明這2個(gè)樣本的相似性最大;低鹽CO2厭氧保存雪菜樣本位于圖的左上方,但與低鹽組和高鹽組樣本位于坐標(biāo)軸同側(cè),反映了這3個(gè)樣本之間有一定的相似性;低鹽N2厭氧保存雪菜樣本位于圖的右下象限,與其他3個(gè)樣本距離較遠(yuǎn),說(shuō)明與其他3個(gè)樣本的相似性較小。圖4也反應(yīng)了不同處理樣本與其揮發(fā)性化合物間的相關(guān)性。從圖中可以看出,雪菜揮發(fā)性物質(zhì)中,脂類、醇類、酸類和醛類與不同鹽量與保存方式相關(guān)。

圖4 不同處理雪菜揮發(fā)性化合物種類主成分分析Fig.4 Difference of volatile components in potherb mustard(Brassica juncea var)of different raw materials

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC-MS)對(duì)高鹽、低鹽、低鹽厭氧(CO2或N2)4組不同處理的雪菜中揮發(fā)性化合物進(jìn)行了研究。在4組雪菜中共檢測(cè)出46、40和46、44種揮發(fā)性化合物,主要包括酯類、醛醇類、酸類、烷烴及其雜環(huán)類物質(zhì),其共同構(gòu)成了雪菜的整體風(fēng)味。異硫氰酸酯類化合物為低鹽、高鹽和低鹽CO2厭氧處理雪菜中最主要揮發(fā)性物質(zhì)。雪菜揮發(fā)性化合物種類差異性分析表明,脂類、醇類、酸類和醛類化合物與不同鹽量、保存方式相關(guān)。