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(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)又名南極大磷蝦,屬甲殼動物綱,最新生物儲存量約為3.79億噸[1-2]。作為地球上最大的單種生物資源之一,南極磷蝦是南極海洋生態(tài)系統(tǒng)中高級捕食者的重要食物來源[3-4]。除具有巨大的生物量,南極磷蝦還具有蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)價值高的特點(diǎn),因此作為潛在的漁業(yè)資源逐漸受到人們關(guān)注[3-6]。

南極磷蝦肌肉蛋白含量高達(dá)60%～65%(干重)[7],蛋白生物值高于肉蛋白及牛奶蛋白,僅次于雞蛋蛋白[8];同時,南極磷蝦脂質(zhì)是一種新型的海洋功能性油脂,含量為4.45%～0.25%(濕重)[9],其營養(yǎng)性相對較高。在我國人口眾多、自然資源相對匱乏的大國背景下,南極生物資源綜合開發(fā)利用具有著重要的戰(zhàn)略意義[6]。

然而，目前南極磷蝦蛋白資源利用度有限,根據(jù)已有文獻(xiàn),南極磷蝦體內(nèi)含有大量自溶酶,死后酶活控制系統(tǒng)急劇減弱,肌肉自溶會導(dǎo)致蝦肉功能特性和品質(zhì)下降[8,10];同時,肌肉在冷凍儲藏過程中,蛋白會發(fā)生變性,蛋白功能性質(zhì)隨之降低[11];此外,蝦體水分升華、蛋白分解、脂肪發(fā)生氧化等也會導(dǎo)致蝦體品質(zhì)下降[11-13]。

國內(nèi)外已有文獻(xiàn)主要分析了南極磷蝦凍藏過程鹽溶性蛋白含量與成糜性質(zhì)的變化[11,13-14]。這些研究對冷凍貯藏的該蛋白功能性分析缺少全面性,冷凍貯藏過程中水溶性蛋白、堿溶性蛋白和不溶性蛋白的變化分析較少。且已有文獻(xiàn)貯藏時間較短[3,11],缺乏全面性。因此,本實(shí)驗(yàn)在60～200 d范圍內(nèi),研究了南極磷蝦全蝦(不去頭、不去皮)、蝦肉(去頭、去皮)在凍藏過程中的蛋白組成(尤其是堿溶性蛋白、不溶性蛋白含量)變化并對各指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析,以期為開發(fā)新的南極磷蝦蛋白產(chǎn)品提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍南極磷蝦全蝦(不去頭、不去皮)和蝦肉(去頭、去皮) 遼寧大連漁業(yè)有限公司,于2017年3月捕撈,2017年5月運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室凍藏于-20 ℃冰箱待使用；3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]-丙磺酸(CHAPS)、低熔點(diǎn)瓊脂糖 美國Bio-Rad公司;二硫蘇糖醇(DTT)、過硫酸銨(AP)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED) 美國 Amersham公司;碘乙酰胺(IAA) 瑞典Amersham公司;覆蓋油(Cover Oil) 美國GE公司;磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·7H2O)、氯化鈉(NaCl)、三氯乙酸(TCA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、氯仿 上海國藥集團(tuán);所用試劑均為分析純。

TGL16型高速冷凍離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司;Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀 瑞典FOSS公司;ETTAN IPGphor 3型等電聚焦電泳儀 美國GE公司;ESH105型水分測定儀 上海舜宇恒平有限公司;PHS-3C型酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;UV-2550型紫外分光光度計(jì) 蘇州島津儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦貯藏條件 南極磷蝦捕撈后運(yùn)輸期間和后期實(shí)驗(yàn)期間貯藏均為-20 ℃凍藏。運(yùn)輸時間包括在內(nèi),因而凍藏時間從60 d算起,分別為60、80、100、120、140、160、200 d。樣品有脫殼蝦肉和未脫殼的全蝦兩種,在貯藏時間節(jié)點(diǎn)取樣,取樣量為10 g。將所取樣品直接在未解凍狀態(tài)下打碎,至于4 ℃下備用,經(jīng)預(yù)處理的樣品在12 h內(nèi)用完。每次隨機(jī)取待測樣3份進(jìn)行測量。

1.2.2 各蛋白組分的分離提取與測定 不同蛋白組分提取根據(jù)Kolakowski[15]的方法稍作改變,取10 g混合均勻的待測樣品,與冷藏蒸餾水(1∶10) g/mL混合,勻漿,置于4 ℃抽提10 min,8500 r/min離心10 min,分離總水溶性蛋白和剩余蛋白;在總水溶性蛋白中加入10%的三氯乙酸(1∶1),靜置分離,分別得非蛋白氮(NPN)(溶液)和水溶性蛋白(沉淀);在剩余蛋白中加入1.1 mol/L NaCl-0.1 mol/L的磷酸緩沖液,置于4 ℃抽提10 min,8500 r/min離心15 min,分離得鹽溶性蛋白(溶液)和沉淀;在沉淀中加入0.1 mol/L NaOH,置于4 ℃抽提10 min,8500 r/min離心15 min,分離得堿溶性蛋白(溶液)和不溶性蛋白(沉淀)。蛋白含量測定采用凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)。

1.2.4 水分含量 用水分測定儀測定,溫度參數(shù)設(shè)定為105 ℃。取約1.5 g的勻漿樣品分別放置在水分測定儀托盤中,每組樣品測量三次,取平行。結(jié)果用%表示。

1.2.5 持水率 根據(jù)Robertson等[17]法稍做改動,取質(zhì)量(M)為30 g勻漿的待測樣品于離心管,4 ℃條件下9000 r/min離心15 min,倒去上層汁液,稱量殘余蝦肉質(zhì)量(m),以損失汁液占待測樣品鮮質(zhì)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算為汁液持水率(W),即

1.2.6 pH 根據(jù)Fan等[18]法稍作改動,稱取(10±0.01) g勻漿的待測樣品,以1∶10加去離子水,勻漿機(jī)混勻,4 ℃浸提10 min,8500 r/min離心10 min,取上清液,用pH計(jì)測定。

1.2.7 硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS) 根據(jù)Zhang等[19]的方法，稱取25 g混勻樣品于錐形瓶中,加入50 mL 7.5%的TCA溶液,振蕩提取30 min,于6500 r/min離心10 min。準(zhǔn)確移取5 mL上清液于離心管中并加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液,90 ℃水浴40 min,取出于冷水中快速冷卻,加入5 mL氯仿后,振蕩搖勻后靜置分層,以1600 r/min離心5 min,上清液分別在532、600、450 nm處測吸光值,以5 mL三氯乙酸溶液加5 mL TBA作為樣品空白對照。

TBA(mol/L)=6.45×A532-A600-0.56×A450

TBARS(mg MDA/kg)=(TBA(mol/L)×10-3×144.15×10)[m×(1-w)]

兩臺相機(jī)的對焦系統(tǒng)都是各自品牌的頂級配置。X-H1的混合對焦系統(tǒng)能夠應(yīng)付大部分場景，只有在非常極端的情況下才會輸給尼康D500，我們認(rèn)為一部分原因是相位對焦系統(tǒng)原理更直接，技術(shù)上也更成熟，另一部分因?yàn)闊o延時的光學(xué)取景器讓用戶可以更容易地將對焦點(diǎn)對準(zhǔn)運(yùn)動物體。

式中,TBARS(mg MDA/Kg):硫酸巴比妥酸反應(yīng)物(干重);m:樣品的質(zhì)量(g);w:對應(yīng)樣品的水分含量(%),A:不同波長下的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計(jì)算用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD),最小顯著性差異(LSD)(p<0.05),使用平均值之間的比較差異。數(shù)據(jù)用Origin 8.5,SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析,三次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組分蛋白含量的變化

凍藏初期(60 d)南極磷蝦全蝦和蝦肉水溶性蛋白分別占總蛋白的23.87%和15.26%,鹽溶性蛋白占19.24%和37.3%,堿溶性蛋白占19.44%和17.91%,不溶性蛋白占4.89%和2.95%。

圖1顯示,全蝦的水溶性蛋白、堿溶性蛋白和不溶性蛋白均高于蝦肉,鹽溶性蛋白含量顯著低于蝦肉(p<0.05)。隨凍藏時間的增加,全蝦和蝦肉中水溶性蛋白含量略有減少,鹽溶性蛋白含量下降,堿溶性蛋白含量上升,不溶性蛋白含量變化不大。至凍藏200 d,全蝦和蝦肉的鹽溶性蛋白分別由19.24%和37.3%降至11.9%和28.5%;堿溶性蛋白則由19.44%和17.91%增至32.91%和27.79%,這兩種變化均具有顯著性差異(p<0.05)。從實(shí)驗(yàn)開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,水溶和不溶性蛋白成分的變化均未有顯著性差異(p>0.05)。有文獻(xiàn)認(rèn)為，這種鹽溶性蛋白含量的減少與磷蝦體內(nèi)的自溶酶存在有關(guān)[20-21];而堿溶性蛋白含量增加則與凍藏過程中蛋白分子間氫鍵、疏水鍵、二硫鍵和鹽鍵等的形成有關(guān)[22-26]。依據(jù)以上文獻(xiàn)邏輯,鹽溶性蛋白的降低可能會帶來水溶性蛋白含量的增加,然而本文試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)這種相應(yīng)的變化。因?yàn)樵谧匀苊负臀⑸锏淖饔孟?隨凍藏時間增加蛋白會降解為胺類物質(zhì)[11],因而部分水溶性蛋白可能發(fā)生降解。

圖1 凍藏過程中南極磷蝦全蝦(a)和蝦肉(b)不同組分蛋白含量變化Fig.1 Changes in protein contents of different protein components of whole krill(a) and krill meat(b)during frozen storage

鹽溶性蛋白是魚蝦成糜性的重要蛋白,其含量影響糜制品的凝膠性能[27],因此,長期凍藏的南極磷蝦不會是理想的成糜性原料,這一推測與已有報道相吻合[28]。由此來看,應(yīng)另選技術(shù)或產(chǎn)品形式來對南極磷蝦中的優(yōu)質(zhì)蛋白加以利用。

2.2 非蛋白氮(NPN)的變化

凍藏初期(60 d時),全蝦和蝦肉的NPN含量分別為20.72%和14.83%。圖2顯示,隨著凍藏時間增加,南極磷蝦全蝦和蝦肉的NPN含量不斷增加。凍藏200 d后,全蝦和蝦肉的NPN含量分別增至27.36%和24.87%,與凍藏初期有顯著性差異(p<0.05)。

圖2 凍藏對南極磷蝦全蝦和蝦肉NPN含量的影響Fig.2 Effects of frozen storage on NPN contents of Antarctic krill whole krill and krill meat

NPN是蛋白氮以外的多肽氮、游離氨基酸、胺類及胺氧化物、核酸肽氮及揮發(fā)性鹽基氮等的總和[29]。相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為,長時間凍藏中NPN值的增加主要與嗜寒性腐敗微生物(如乳酸菌等)有關(guān)[11,30]。因此,水溶性蛋白含量(圖1)相對穩(wěn)定的主要原因在于:肌肉蛋白在自溶酶作用下發(fā)生自溶[20-21],因而鹽溶性蛋白可能被降解為水溶性蛋白;而腐敗微生物作用于蛋白產(chǎn)生胺類物質(zhì)[11],故部分水溶性蛋白可能被降解成NPN。

2.3 不同組分蛋白的雙向電泳圖

圖3顯示,凍藏初期(60 d)南極磷蝦的水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、堿溶性蛋白的蛋白點(diǎn)數(shù)均多于凍藏終期(200 d)的蛋白點(diǎn)數(shù)。從等電點(diǎn)來看,水溶性蛋白(圖3a1～a2)和堿溶性蛋白(圖3c1～c2)的蛋白點(diǎn)主要分布在pH4～6和pH8～9;鹽溶性蛋白(圖3b1～b2)的蛋白點(diǎn)均大多集中在酸性端(pH4～6)。

圖3 南極磷蝦水溶性蛋白(a1&a2),鹽溶性蛋白(b1&b2)和堿溶性蛋白(c1&c2)雙向電泳圖Fig.3 2-DE spectrum of Antarctic krill water-soluble protein(a1&a2),salt-soluble protein(b1&b2)and alkali-soluble protein(c1&c2)注:a1、b1、c1:凍藏初期(60 d);a2、b2、c2:凍藏終期(200 d)。

從分子量來看,凍藏初期和終期水溶性蛋白點(diǎn)(圖3a1～a2)變化不大,大多數(shù)分布在分子量為25～55 kDa,少數(shù)分布在分子量<15 kDa;凍藏終期25～55 kDa區(qū)域的蛋白點(diǎn)有少量丟失。凍藏初期鹽溶性蛋白點(diǎn)(圖3b1)主要分布在25～130 kDa和<15 kDa;凍藏終期(圖3b2)蛋白點(diǎn)則更趨集中于25～55 kDa,而>55 kDa和<15 kDa的蛋白點(diǎn)相對含量明顯減少。

鹽溶性蛋白主要成分是肌原纖維蛋白,該蛋白主要包括480 kDa的大分子肌球蛋白、肌動蛋白(43 kDa)和原肌球蛋白(38 kDa)。每個肌球蛋白分子由兩條210 kDa的重鏈和四條17～23 kDa的輕鏈組成[27]。由圖3可知,從凍藏初期到終期,肌動蛋白、原肌球蛋白損失較少;而肌球蛋白的重鏈和輕鏈均出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p失。該結(jié)果可能與自溶酶的降解相關(guān)。而鹽溶性蛋白結(jié)構(gòu)破壞也影響蛋白的凝膠性[27]。

凍藏初期到終期,堿溶性蛋白點(diǎn)(圖3c1～c2)在整個分子量區(qū)域均有分布,這與文獻(xiàn)所報道的凍藏過程中堿溶性蛋白增加機(jī)理相吻合[22-26],自溶酶對堿溶性蛋白點(diǎn)的相對成分分布影響不大。結(jié)合前文(圖1),堿溶性蛋白含量的增加可能和冷凍變性相關(guān)。

2.4 含水量和持水率的變化

圖4表明，隨凍藏時間的增加,南極磷蝦的含水量和持水率均呈下降趨勢。全蝦和蝦肉水分含量凍藏初期為79.06%和84.31%,終期分別下降至74.21%和81.47%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,凍藏終期兩組含水量均有顯著性下降(p<0.05)。這可能由于凍藏過程中存在升華現(xiàn)象所致[12]。

圖4b顯示，全蝦和蝦肉持水率從凍藏初期的71.52%和69.17%分別下降至終期的59.46%和65.69%,統(tǒng)計(jì)分析表明,其降幅顯著(p<0.05)。持水率表示肌肉蛋白對水的保持能力,持水率越高,說明肌肉蛋白成糜性越好[31]。這種水分保持能力的喪失與肌原纖維蛋白的三維結(jié)構(gòu)冷凍變性相關(guān)[32],這與堿溶性蛋白大量增加的原因相一致。

圖4 凍藏對南極磷蝦全蝦和蝦肉含水量和持水率的影響Fig.4 Effects of frozen storage on moisture contents and holding water contents of Antarctic krill whole krill and krill meat

2.5 pH的變化

pH是反應(yīng)蝦品質(zhì)變化的指標(biāo)之一。圖5顯示,在凍藏過程中南極磷蝦全蝦和蝦肉的pH均呈上升趨勢。統(tǒng)計(jì)分析表明,全蝦中的pH上升具有顯著性差異(p<0.05),而蝦肉的pH僅從6.95增至7.12。在自溶酶和微生物作用下,蛋白分解成胺類及氨等堿性物質(zhì)[11],因而pH逐漸增加。凍藏期間,全蝦的pH明顯高于蝦肉,這是因?yàn)槟蠘O磷蝦的消化腺酶主要存在于蝦頭胸部,因而相較于去皮去頭的蝦肉,全蝦含有較多的自溶酶[20]。

圖5 凍藏對南極磷蝦全蝦和蝦肉pH的影響Fig.5 Effects of frozen storage on pH of Antarctic krill whole krill and krill meat

2.6 TBARS值的變化

TBARS值可作為蝦肌肉中脂肪氧化程度的蝦品質(zhì)指標(biāo)[3,9]。南極磷蝦中不飽和脂肪酸含量高,易發(fā)生氧化,因而TBARS值變化可反映南極磷蝦在凍藏過程中的品質(zhì)變化[3]。圖6顯示,凍藏過程中南極磷蝦全蝦的TBARS值從初期的1.94 mg MDA/kg先極速增加,100 d后增加趨勢放緩,至終期增加為10.4 mg MDA/kg。統(tǒng)計(jì)分析顯示,全蝦的TBARS值增加顯著(p<0.05)。蝦肉的TBARS值也有緩慢的增加趨勢,從初期0.5 mg MDA/kg增加至3.56 mg MDA/kg,但差異并不顯著(p>0.05)。說明隨著凍藏時間的增加,南極磷蝦的氧化程度增加,品質(zhì)下降。

圖6 凍藏對南極磷蝦全蝦和蝦肉TBARS值的影響Fig.6 Effects of frozen storage on TBARS value of Antarctic krill whole krill and krill meat

2.7 各指標(biāo)間相關(guān)性分析

對全蝦和蝦肉各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表1所示,凍藏過程中全蝦含水量與持水率呈顯著正相關(guān)(p<0.05);pH與含水量、持水率呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01);持水率與TBARS值呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05);pH與TBARS值呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。凍藏過程中蝦肉含水量與TBARS值呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)。這說明,含水量、持水率、pH和TBARS值的變化在反映南極磷蝦品質(zhì)隨凍藏時間的變化方面具有一定的一致性。

表1 全蝦和蝦肉各指標(biāo)間相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis among various indexes of Antarctic krill whole krill and krill meat

3 結(jié)論

從凍藏初期到終期,南極磷蝦全蝦和蝦肉鹽溶性蛋白下降顯著(p<0.05),堿溶性蛋白和NPN顯著上升(p<0.05),說明各組分蛋白含量隨凍藏時間增加發(fā)生變化,進(jìn)而影響蛋白的凝膠性。二維電泳結(jié)果說明了鹽溶性蛋白的損失主要發(fā)生在肌球蛋白重鏈(210 kDa)和輕鏈(17～23 kDa)分子上,進(jìn)一步表明60～200 d的長時間凍藏可降低南極磷蝦蛋白的凝膠性,堿溶性蛋白中蛋白點(diǎn)的分布基本不變,其含量的增加則可能主要和冷凍變性相關(guān)。從凍藏60 d起,至凍藏200 d止,全蝦和蝦肉的含水量和持水率均顯著下降(p<0.05),而pH和TBARS值僅在全蝦中出現(xiàn)顯著升高現(xiàn)象(p<0.05),表明全蝦和蝦肉品質(zhì)均會劣化,蝦肉較全蝦的劣化程度為輕。各指標(biāo)相關(guān)性分析表明，凍藏過程中南極磷蝦各品質(zhì)指標(biāo)的變化趨勢具有一定的一致性。

綜上,南極磷蝦蛋白的最大特點(diǎn)在于,堿溶性蛋白含量較高,且在凍藏過程中大量增加;而鹽溶性蛋白降解顯著。因而,未來考慮其蛋白成分的應(yīng)用和產(chǎn)品化技術(shù)開發(fā)時,應(yīng)盡量避免進(jìn)行成糜性能研究。