李忠洋, 林軍章, 錢 欽，馮 云, 王 磊, 汪衛(wèi)東, 李希明

(1.中國石油長慶油田分公司第六采油廠采油工藝研究所, 陜西西安 751500; 2.中國石油勝利油田分公司石油工程技術研究院,山東東營 257000)

微生物采油分為內(nèi)源微生物采油技術和外源微生物采油技術,后者是指將具有采油功能微生物在地面發(fā)酵后注入到油藏中進行驅(qū)油的技術。該技術主要針對內(nèi)源微生物匱乏的油藏,具有目標功能菌明確的優(yōu)勢[1-6],外源微生物油藏適應性是其能否在油藏內(nèi)發(fā)揮作用的關鍵。油藏作為厭氧環(huán)境,微生物厭氧生長代謝能力決定其油藏適應性和驅(qū)油性能。前期多數(shù)外源菌采油相關性能研究都是在好氧條件下開展[7-10],而嚴格厭氧條件下的外源菌生長代謝以及調(diào)控方法研究較少,筆者以一株采油常用的地衣芽孢桿菌為對象,研究其在厭氧條件下的生長代謝及調(diào)控方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

實驗用菌株分離自勝利油田60 ℃油藏產(chǎn)出液中,現(xiàn)保存于中石化微生物采油重點實驗室的菌種保藏中心。菌株經(jīng)16SDNA測序鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。

1.2 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基:葡萄糖4 g/L,酵母粉1 g/L,蛋白胨 1 g/L,磷酸氫二鉀3 g/L。

優(yōu)化培養(yǎng)基:添加硝酸鈉作為電子受體,在上述基礎培養(yǎng)基中分別添加0、1、3、6 g/L不同質(zhì)量濃度硝酸鈉。

1.3 方 法

1.3.1 菌株厭氧培養(yǎng)方法

采用亨蓋特微生物厭氧操作平臺進行微生物厭氧培養(yǎng)基制備和培養(yǎng),實驗步驟為:①在250 mL厭氧培養(yǎng)瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基;②厭氧瓶中用高純氮氣除氧,分裝后密閉120 ℃滅菌;③滅菌后培養(yǎng)基中接種5 mL菌株種子液,60 ℃培養(yǎng),不同時間取樣分析。

1.3.2 微生物生長曲線測定

不同培養(yǎng)時間取培養(yǎng)液離心,菌體重懸后利用紫外分光光度計在600 nm下測試OD值。

1.3.3 微生物乳化能力評價

微生物乳化能力利用乳化指數(shù)方法評價,即在25 mL定量管中將微生物培養(yǎng)液樣品與柴油等量混合,振蕩器均勻振蕩3 min后靜止5 min測定乳化層高度(H1)和未乳化層高度(H2),計算柴油乳化指數(shù)(R):R=H1/(H1+H2)。

1.3.4 微生物產(chǎn)氣量分析

微生物厭氧培養(yǎng)體系產(chǎn)氣量是利用壓力表通過檢測厭氧瓶上部頂空的氣體壓力計算得出,獲得體系壓力通過公式n=PV/RT計算產(chǎn)氣物質(zhì)的量。

1.3.5 生物乳化劑提取方法

60 ℃培養(yǎng)48 h后,培養(yǎng)液于4 ℃、8 000 r/min 離心20 min 除去菌體后,過0.22 μm膜,在上清液中加入3倍體積4 ℃預冷的酒精,用玻璃棒攪拌均勻,置于-20 ℃、 4 h。8 000 r/min 離心2 min,沉淀用蒸餾水重懸透析后冷凍干燥,得乳化劑粗提物,20 ℃ 保存。

1.3.6 生物乳化劑種類鑒定

生物乳化劑粗提物分別進行糖和蛋白質(zhì)定量分析:總糖含量測定采用蒽酮-硫酸法測定[11];蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法測定[12];蛋白質(zhì)電泳采用SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳操作方法[13]。

1.3.7 生物乳化劑結(jié)構(gòu)紅外光譜分析

生物乳化劑粗提物在進行紅外光譜分析之前,要將溴化鉀和生物乳化劑(粗品)在研缽中磨碎,制作壓片,進行紅外光譜分析。

1.3.8 揮發(fā)性脂肪酸分析

揮發(fā)性脂肪酸分析進樣量50 μL,檢測條件進樣溫度為300 ℃,檢測器(FID) 溫度為300 ℃,升溫程序為: 100 ℃(3 min)—10 ℃/min—240 ℃ (20 min),載氣為恒流1 mL/min 的氮氣。

1.4 物理模擬驅(qū)油

利用室內(nèi)物理模擬實驗,考察菌株厭氧激活條件下的驅(qū)油效率。實驗模擬勝利油田沾3區(qū)塊油藏條件,實驗過程為填裝石英砂巖心,滲透率1 μm2,抽真空、飽和實驗區(qū)塊的地層水,計算巖心的孔隙體積(VP),飽和實驗區(qū)塊的脫水脫氣原油,計算巖心的原始含油量,靜置老化7 d。巖心一次水驅(qū)3倍孔隙體積,一次水驅(qū)至巖心產(chǎn)出液含水率與實驗區(qū)塊油井平均含水率一致。注入0.3VP菌株和營養(yǎng)劑,其中菌株培養(yǎng)液占10%,營養(yǎng)劑為葡萄糖4 g/L,酵母粉1 g/L,蛋白胨 1 g/L,磷酸氫二鉀3 g/L,硝酸鈉3 g/L,在60 ℃下恒溫培養(yǎng)15 d。注地層水開展二次水驅(qū),待巖心出口含水率與區(qū)塊油井平均含水率一致時停止水驅(qū),計算驅(qū)油效率,同時進行3根巖心管平行實驗。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株不同條件下的生長曲線

該株地衣芽孢桿菌為兼性微生物,在好氧和厭氧條件下均可以生長(圖1),但從生長曲線對比發(fā)現(xiàn),好氧生長速率遠高于厭氧生長速率,好氧10 h達到峰值,而厭氧需要95 h達到峰值,且好氧生長菌體量明顯高于厭氧生長的菌體量,好氧菌體OD600達到0.37,而厭氧OD600僅為0.85。厭氧生長代謝明顯弱于好氧生長代謝主要是該菌株前期篩選和培養(yǎng)都是在好氧條件下進行,當從好氧生長環(huán)境轉(zhuǎn)移到厭氧生長環(huán)境后,菌株需要更長的時間適應厭氧環(huán)境。當把該菌株在厭氧環(huán)境中反復培養(yǎng)傳代馴化5次以上,菌株在厭氧條件下的生長速率明顯提高,48 h就達到生長的最大值,比初始縮短了近100 h,而且生物量也明顯提升(圖2)。該研究結(jié)果表明外源菌通過好氧發(fā)酵的方式生產(chǎn)后注入油藏后適應性弱,好氧發(fā)酵生產(chǎn)的外源菌需要同時配注空氣來提高其油藏適應性,或者通過厭氧發(fā)酵方式生產(chǎn)外源菌提高其油藏適應性。

圖1 地衣芽孢桿菌厭氧和好氧生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus licheniformis under anaerobic and aerobic conditions respectively

圖2 地衣芽孢桿菌厭氧培養(yǎng)傳代后生長曲線Fig.2 Growth curve of Bacillus licheniformis after acclimation through subcultivation in anaerobic condition

2.2 菌株厭氧乳化特性

原油的生物乳化是微生物驅(qū)油重要驅(qū)油機制,而微生物對原油的厭氧乳化能力研究相對較少,因此對菌株的厭氧代謝乳化能力評價以認識其驅(qū)油潛力。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)整硝酸鹽質(zhì)量濃度對菌株厭氧生長代謝產(chǎn)乳化劑方面有明顯影響(圖3),當硝酸鈉質(zhì)量濃度提高到1 g/L以上時乳化指數(shù)能達到100%,但當硝酸鈉質(zhì)量濃度達到6 g/L時乳化指數(shù)反而降低,只有73%。上述實驗結(jié)果表明添加適當比例電子受體對該菌株厭氧生長代謝產(chǎn)乳化劑具有促進作用,但硝酸鹽濃度過高后乳化指數(shù)反而降低,這表明高電子受體條件下會降低該菌株合成乳化劑途徑的代謝效率。

2.3 菌株厭氧代謝乳化劑產(chǎn)物

該菌株厭氧培養(yǎng)液提取出的乳化劑粗提物產(chǎn)率為0.25 g/g底物,其中總糖占生物乳化劑總量的35.1%;蛋白質(zhì)占生物乳化劑總量的16.0%,由此可知該生物乳化劑主要是糖和蛋白質(zhì)的聚合物。該乳化劑粗提物經(jīng)蛋白酶K處理后,乳化指數(shù)變?yōu)?,說明蛋白組成部分是該類乳化劑的主要活性組分。

紅外光譜分析(圖4)發(fā)現(xiàn),該生物乳化劑在3 423.37 cm-1處的吸收峰為N—H的伸縮振動的強吸收峰;在2 925.84、1 311.84和1 241.88 cm-1處的吸收峰是C—H的伸縮振動峰;1 653.52 cm-1處的吸收峰是C=O的伸縮振動引起的;1 154～1 030 cm-1內(nèi)存在低波數(shù)1 039.78 cm-1的強吸收,為O—H的伸縮振動的特征吸收;由紅外光譜看出該乳化劑中含有較多的—OH和RCO—NHR 基團,這些基團為糖和蛋白的特征官能團。由此進一步推測糖和蛋白質(zhì)為該乳化劑的主要化學組分。

圖3 硝酸鈉對地衣芽孢桿菌厭氧乳化液體石蠟和乳化指數(shù)影響Fig.3 Effect on emulsion index of Bacillus licheniformis under anaerobic condition

通過蛋白質(zhì)電泳圖(圖5)看出,26 000的蛋白質(zhì)的條帶顏色較亮,說明組成的蛋白中存在含量較多的26 000的蛋白質(zhì)。研究最多的生物乳化劑是Emulsan,其主要結(jié)構(gòu)為脂多糖類[14],另一類研究較多生物乳化劑是Alasan,為高分子聚糖和蛋白質(zhì)的復合物,其乳化活性物質(zhì)也主要是蛋白質(zhì),其中45 000的外膜蛋白A(OmpA)類似物前體(AlnA)是其乳化能力最強部分[15]。由此推測菌株所產(chǎn)乳化劑結(jié)構(gòu)與Alasan更為接近。

圖4 生物乳化劑紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of bioemulsifier that Bacillus licheniformis produced

圖5 生物乳化劑蛋白質(zhì)電泳圖Fig.5 Electrophoresis graph of protein from bioemulsifier

目前研究主要集中在微生物好氧代謝產(chǎn)乳化劑,例如王志榮等篩選獲得一株在好氧條件下產(chǎn)乳化劑菌株Serratiasp.SCH—l,該菌株好氧條件下乳化劑產(chǎn)率為0.75 g/L,但未考察其厭氧條件下的乳化能力[16]。目前已報道的能夠厭氧產(chǎn)表面活性劑的菌種資源比較少。Youssef等[17]發(fā)現(xiàn)巴氏梭狀芽胞桿菌(Clostridiumpasteurianum)能在厭氧條件下產(chǎn)生胞外中性脂類表面活性劑,地衣芽胞桿菌RS-I和枯草芽胞桿菌NRRLB-23049能夠在厭氧條件下產(chǎn)生脂肽類表面活性劑。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 10145在棕櫚酸一硝酸鹽培養(yǎng)基中,可以通過硝酸鹽呼吸在缺氧條件下合成鼠李糖脂表面活性劑[18]。厭氧表面活性劑產(chǎn)率普遍較低,而且均為厭氧產(chǎn)小相對分子質(zhì)量的表面活性劑,相對分子質(zhì)量在1 000以內(nèi)。筆者首次發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌桿菌在厭氧條件下產(chǎn)大相對分子質(zhì)量蛋白多糖類乳化劑[19]。

2.4 厭氧代謝產(chǎn)氣特性

微生物產(chǎn)氣是微生物驅(qū)油的另一個重要機制,通過產(chǎn)生生物氣溶解于原油可以降低原油黏度,同時提高儲層壓力,從而提高驅(qū)油效率。該菌株在厭氧環(huán)境下能夠產(chǎn)生生物氣,氣體組分分析發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生物氣為二氧化碳(表1),而且二氧化碳含量隨著硝酸鈉質(zhì)量濃度升高而升高,當硝酸鈉質(zhì)量濃度為6 g/L時二氧化碳產(chǎn)量達到7.3 mmol(圖6),說明電子受體提高了微生物的厭氧代謝活性,促進了菌株產(chǎn)氣能力。

表1 菌株厭氧代謝產(chǎn)氣氣體組分

圖6 硝酸鹽對菌株厭氧代謝產(chǎn)氣量影響Fig.6 Effect of nitrate on gas production strains of anaerobic metabolism

2.5 揮發(fā)性脂肪酸分析

乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸是微生物厭氧代謝的重要中間代謝產(chǎn)物,通常會作為油藏微生物代謝活躍程度的一個重要指標被監(jiān)測。該菌株在厭氧代謝過程中也會產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,隨著培養(yǎng)時間延長其質(zhì)量濃度不斷提高,但硝酸鈉質(zhì)量濃度增加,所產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸質(zhì)量濃度反而降低,未添加硝酸鈉的樣品中脂肪酸質(zhì)量濃度達到876 mg/L,而添加質(zhì)量濃度為6 g/L硝酸鈉的樣品脂肪酸質(zhì)量濃度僅為277 mg/L(圖7)。添加硝酸鈉導致?lián)]發(fā)性脂肪酸質(zhì)量濃度降低,主要是由于硝酸鈉的添加促進了該菌株厭氧代謝產(chǎn)氣,根據(jù)物質(zhì)守恒定律,當總的底物碳源不變的條件下,產(chǎn)氣多的樣品揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量就會減少。

圖7 硝酸鹽對菌株厭氧代謝揮發(fā)性脂肪酸影響Fig.7 Effect of nitrate on volatile fatty acids of strains anaerobic metabolism

2.6 菌株物模驅(qū)油效率評價

在模擬勝利油田沾3區(qū)塊油藏條件,開展菌株厭氧激活驅(qū)油效率評價(圖8),該菌株在一次水驅(qū)含水率達到95%的基礎上,采出程度從40.7%提高到46.8%,驅(qū)油效果顯著,提高采收達到16.0%,含水率下降顯著,由95%下降到87.3%,且產(chǎn)出液中原油存在明顯乳化現(xiàn)象。以上結(jié)果說明,該菌株在油藏條件下能通過乳化和產(chǎn)氣等綜合作用提高水驅(qū)效率,表現(xiàn)出良好的應用潛力。

圖8 菌株物模驅(qū)油過程含水率和采出程度Fig.8 Water cut and degree of reserve recovery in process of physical simulation oil recovery

3 結(jié) 論

(1)采油用地衣芽孢桿菌作為兼性菌在好氧和厭氧條件下均可以生長代謝,通過合適的營養(yǎng)體系可以實現(xiàn)該菌株在厭氧條件下產(chǎn)生乳化、產(chǎn)氣和驅(qū)油功能,展現(xiàn)出良好的油藏適應性和采油潛力。

(2)首次發(fā)現(xiàn)在嚴格厭氧條件下該株地衣芽孢桿菌產(chǎn)生蛋白多糖類大分子乳化劑。

(3)以硝酸鈉作為電子受體可以顯著提高菌株厭氧代謝活性。