張雷，邢靜，李潤(rùn)玖

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧 大連 160011）

膿毒癥是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，通常由感染因素引起，疾病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致器官功能障礙和（或） 循環(huán)障礙，是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染和外科大手術(shù)等常見(jiàn)的并發(fā)癥。盡管如今醫(yī)療技術(shù)逐步提升，膿毒癥死亡率仍居高不下［1-2］。因此，膿毒癥演變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及病理生理機(jī)制值得深入研究，以期探索新的干預(yù)手段或措施。研究［3-4］表明，在膿毒癥患者體內(nèi)，促炎-抗炎的平衡狀態(tài)遭到破壞，炎癥反應(yīng)受控失調(diào)，出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征?；蛘呖寡装Y反應(yīng)過(guò)度亢進(jìn)，使炎性細(xì)胞因子生成受到抑制，引起機(jī)體免疫功能低下，導(dǎo)致機(jī)體處于失衡狀態(tài)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1 （transformation growth factor β 1，TGF-β 1） 在先天性和獲得性免疫中均發(fā)揮重要的作用［5-6］，然而TGF-β 1參與調(diào)節(jié)膿毒癥的發(fā)病是否與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)仍需進(jìn)一步深入探討。

為了探討TGF-β 1在膿毒癥炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制，本研究在盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) （cecal ligation and puncture，CLP） 大鼠模型中，給予外源性 TGF-β 1因子處理，檢測(cè)TGF-β 1干預(yù)后CLP大鼠外周血炎性相關(guān)因子水平和免疫器官重要蛋白的變化，并進(jìn)一步在體外細(xì)胞水平研究對(duì)免疫細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為今后研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取雄性健康清潔級(jí)Wistar 大鼠，6月齡，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 細(xì)胞系：人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.1.3 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；重組TGF-β因子購(gòu)自中國(guó)Bio-Swamp公司，兔抗鼠核因子E2相關(guān)因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nfr2） 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；RNA提取試劑盒、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PCR Master Mix 均購(gòu)自日本TaKaRa公司；MTT試劑購(gòu)自美國(guó)BioAssay公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備大鼠CLP模型：常規(guī)麻醉，消毒腹部，皮膚正中切開(kāi)，暴露盲腸，絲線結(jié)扎盲腸根部，避免腸梗阻，用無(wú)菌4號(hào)絲線緊緊結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端1.5 cm處（長(zhǎng)度很重要，決定膿毒癥的嚴(yán)重程度） ，并用無(wú)菌18號(hào)針頭在已結(jié)扎的盲腸遠(yuǎn)端中央處貫通穿刺，然后把盲腸推回腹腔，關(guān)閉腹腔，逐層縫合。CLP 術(shù)后0.5 h尾靜脈注射 TGF-β 1（20 ng/mL）。

1.2.2 動(dòng)物分組：根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、CLP組、CLP+TGF-β 1組，每組15只。

1.2.3 ELISA：收集大鼠血清樣本。采用雙抗體夾心ELISA 法測(cè)定相關(guān)炎性細(xì)胞因子血清濃度，具體操作步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 Western blotting：取大鼠肝、脾組織，裂解、蛋白提取、變性，SDS-PAGE濃縮膠及分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜1 h，封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜（ 稀釋倍數(shù)均為1∶500） ，PBS洗膜3次，二抗（ 1∶200） 孵育，顯色。GAPDH為內(nèi)參照，采用Quantity One 4.0分析軟件分析蛋白條帶，計(jì)算光密度，目的蛋白與內(nèi)參光密度比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖：細(xì)胞消化后，以5×103/孔的密度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁后無(wú)血清饑餓24 h，給予TGF-β 1處理不同時(shí)間，加入MTT（5 mg/mL） 15 μ L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，去除孔中培養(yǎng)基，加入DMSO溶液 150 μ L/孔，振蕩至結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值 （490 nm波長(zhǎng)） 。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集THP-1細(xì)胞，4×104/mL的密度接種于6孔板，給予TGF-β 1處理，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106；然后將100 μ L的細(xì)胞懸液加入流式管中，加入10 μ L Annexin-V-FITC，隨后加入10 μ L碘化丙啶，室溫下避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用x-±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β 1對(duì)CLP 膿毒癥大鼠促炎/抗炎相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響

采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中不同炎性細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子水平。炎性細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子 TNF-α和白細(xì)胞介素6（interlukin-6，IL-6） 的釋放水平均較低，CLP組大鼠TNF-α和IL-6的釋放水平增高，CLP+TGF-β 1組大鼠給予TGF-β 1處理后血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL- 6水平增高 （P ＜ 0.05） ?？寡准?xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果顯示，CLP+TGF-β 1組大鼠血清中抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平下降 （P ＜ 0.05） ，即降低 CLP膿毒癥大鼠釋放抗炎細(xì)胞因子的能力。見(jiàn)圖1。上述結(jié)果表明，TGF-β 1具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

2.2 TGF-β 1對(duì)CLP 膿毒癥大鼠肝、脾組織中Nrf2蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，CLP組大鼠肝、脾組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低，CLP+TGF-β 1組在給予TGF-β 1處理后，大鼠肝、脾組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平低于CLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖2。

圖1 ELISA法檢測(cè)CLP大鼠血清中炎性細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子水平Fig.1 The level of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines in the serum of CLP rats detected by ELISA

圖2 Western blotting檢測(cè)CLP大鼠肝、脾組織中Nrf2蛋白表達(dá)Fig.2 Nrf2 protein in the spleen and liver of CLP rats detected by Western blotting

2.3 TGF-β 1對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)MTT檢測(cè)給予TGF-β 1處理后單核細(xì)胞THP-1增殖水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，TGF-β 1組的THP-1細(xì)胞增殖活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，TGF-β 1參與THP-1細(xì)胞增殖活性的調(diào)控。

2.4 TGF-β 1對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)給予TGF-β 1處理后細(xì)胞凋亡率的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和TGF-β 1組 THP-1細(xì)胞凋亡率分別為 （9.2±1.2） %和 （26.7±6.6） %，與空白對(duì)照組比較，TGF-β 1組THP-1細(xì)胞的凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖4。

圖3 TGF-β 1對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of TGF-β 1 on cell proliferation in THP-1 cells

3 討論

膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)紊亂，其根本是免疫失衡，這直接決定了感染的發(fā)展過(guò)程。感染與免疫失衡的影響因素眾多，包括： （1） 宿主問(wèn)題 （兒童、成人、老年人、免疫正常、免疫低下及合并癥）； （2）病原體的問(wèn)題 （病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)等）； （3） 環(huán)境和季節(jié)的問(wèn)題 （不同環(huán)境和季節(jié)中，患者感染的發(fā)展過(guò)程也不盡相同） 。病原微生物侵入時(shí)，炎癥相關(guān)因子呈現(xiàn)瀑布式釋放，誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)亢進(jìn)，從而導(dǎo)致由于過(guò)于強(qiáng)大的炎癥反應(yīng)誘發(fā)免疫原性損傷。膿毒癥患者的具體表現(xiàn)是出現(xiàn)大量免疫細(xì)胞凋亡，從而制約機(jī)體免疫抑制效果［7-8］。機(jī)體免疫系統(tǒng)具備的調(diào)控功能在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TGF-β 1對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡水平的影響Fig.4 Apoptosis of cells after TGF-β 1 treatment in the THP-1 cells detected by FACScan

TGF-β具有多種生物學(xué)作用，可調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和多種生理、病理過(guò)程，如參與細(xì)胞周期、血管及胚胎的形成、細(xì)胞凋亡以及免疫等過(guò)程的調(diào)控。有研究［9］表明，TGF-β 1是具有多效免疫調(diào)節(jié)作用的炎性細(xì)胞因子，TGF-β 1參與膿毒癥炎癥反應(yīng)的調(diào)控，通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子釋放從而抵御機(jī)體出現(xiàn)過(guò)度的炎癥反應(yīng)。但也有報(bào)道［10］指出，TGF-β 1可增加TNF-α炎性細(xì)胞因子的生成，促進(jìn)肝急性期反應(yīng)蛋白合成，使動(dòng)物發(fā)展為膿毒癥休克甚至死亡。TGF-β 1在膿毒癥炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。CLP模型具備更好地模擬臨床感染和膿腫形成病程、與膿毒癥相似度更高的優(yōu)點(diǎn)。本研究為了闡明TGF-β 1在膿毒癥免疫抑制發(fā)生中的作用，故采用了與臨床感染和膿毒癥相似度更高的CLP模型。采用CLP制備大鼠膿毒癥模型，觀察TGF-β 1對(duì)膿毒癥大鼠外周血TNF-α及IL-10等因子水平的調(diào)節(jié)作用，探討 TGF-β 1在膿毒癥炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。本研究結(jié)果表明，膿毒癥大鼠尾靜脈注射TGF-β 1后，炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL- 6水平增高，抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平下降，提示TGF-β 1參與膿毒癥炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，但其作用機(jī)制復(fù)雜，難以絕對(duì)用促炎或抗炎的結(jié)論對(duì)其進(jìn)行歸類(lèi)。

Nrf-2由2.2 kb的堿基編碼，相對(duì)分子量為 66 000［11］，Nrf2是最原始的調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化基因，能調(diào)控多個(gè)基因表達(dá)，是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。當(dāng)氧化物、炎癥介質(zhì)等損傷因素刺激引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變時(shí)，Nrf2發(fā)生磷酸化改變，與Keapl解離后進(jìn)入細(xì)胞核［12］。研究［13］顯示，Nrf2可以減弱急性期炎癥反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)大鼠敲除Nrf2基因，炎癥反應(yīng)加重，易發(fā)生腹膜炎和膿毒性休克，死亡率增加。有研究表明，Nrf2在脾、肺組織中豐富，其次為肝臟，主要集中在相應(yīng)的免疫器官中。本研究中，空白對(duì)照組中大鼠的肝、脾組織中可檢測(cè)到Nrf2蛋白的表達(dá)。CLP組Nrf2表達(dá)明顯降低，提示強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)可損害機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，破壞組織和細(xì)胞，引起Nrf2水平降低、轉(zhuǎn)錄活性下降，機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和自然免疫反應(yīng)抑制。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，TGF-β 1能夠抑制單核細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。因此推斷TGF-β 1可能對(duì)膿毒癥發(fā)展后期的免疫抑制過(guò)程起到促進(jìn)作用，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。

總之，本研究結(jié)果提示TGF-β 1參與膿毒癥大鼠的免疫抑制，可抑制免疫器官中Nrf2表達(dá)、抑制單核細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。