張藝祎, 吳小倩, 曹孟霞, 沈立明, 翟俊文, 吳沙沙

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)蘭科植物保護(hù)與利用國(guó)家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

獨(dú)蒜蘭屬PleioneD. Don植物隸屬于蘭科(Orchidaceae)，主要分布在喜馬拉雅亞熱帶山區(qū)，中國(guó)云南是獨(dú)蒜蘭屬植物的多樣性分布中心[1-2].獨(dú)蒜蘭屬植物共有27種[3-5]，已確定的天然雜交種有9個(gè)[3,6-7]，由于一些種在地理分布、開(kāi)花時(shí)間以及傳粉者方面存在重疊，導(dǎo)致物種間的生殖隔離弱，雜交相對(duì)容易.目前，英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)已注冊(cè)了517個(gè)獨(dú)蒜蘭雜交組合[8].盡管獨(dú)蒜蘭屬植物被廣泛栽培和應(yīng)用，但屬下進(jìn)化關(guān)系一直不清，一些種的分類地位尚存爭(zhēng)議，如流蘇獨(dú)蒜蘭P.barbaraeBraem.流蘇獨(dú)蒜蘭最早是由Barbara Pinkepank于1999年在云南發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為是獨(dú)蒜蘭屬的新種并命名為P.barbaraeBraem[9].流蘇獨(dú)蒜蘭的部分形態(tài)特征與大花獨(dú)蒜蘭P.grandiflora(Rolfe) Rolfe相似，花瓣大小相近，唇瓣邊緣及褶片均呈撕裂狀，頂端微凹；而流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭的背萼片、花瓣、唇瓣形狀存在差異，花色也有明顯不同.Cribb et al[1]推測(cè)流蘇獨(dú)蒜蘭可能是大花獨(dú)蒜蘭與獨(dú)蒜蘭或美麗獨(dú)蒜蘭的雜交后代，但由于獨(dú)蒜蘭、美麗獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭均沒(méi)有重疊分布區(qū)，遂將流蘇獨(dú)蒜蘭歸并為大花獨(dú)蒜蘭.中國(guó)植物志英文版(FOC)和世界植物名錄(World Checklist of Selected Plant Families)也將P.barbaraeBraem作為大花獨(dú)蒜蘭的異名處理[2-3].此外，曾有學(xué)者采用DNA分析認(rèn)為，流蘇獨(dú)蒜蘭是以大花獨(dú)蒜蘭與獨(dú)蒜蘭復(fù)合體(該復(fù)合體包含獨(dú)蒜蘭、美麗獨(dú)蒜蘭、臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭和四川獨(dú)蒜蘭，因各種之間極易雜交和出現(xiàn)多倍化的現(xiàn)象，難以通過(guò)簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)的方法進(jìn)行準(zhǔn)確分類，故歸為獨(dú)蒜蘭復(fù)合體類群)之一為親本的天然雜交種，但該結(jié)果并未正式發(fā)表，僅見(jiàn)Paul[10]的報(bào)道.由此可見(jiàn)，流蘇獨(dú)蒜蘭的分類和界定在學(xué)術(shù)界尚存在爭(zhēng)論，其與大花獨(dú)蒜蘭的分類關(guān)系混亂，將其視作大花獨(dú)蒜蘭的一個(gè)異名還是大花獨(dú)蒜蘭與其他種的天然雜交種尚有待進(jìn)一步分子水平的驗(yàn)證.因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)核基因(nrITS)和葉綠體基因序列(cpDNA)構(gòu)建獨(dú)蒜蘭屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，探討流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭及其疑似親本的親緣關(guān)系，旨在為獨(dú)蒜蘭屬下分類研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試野生流蘇獨(dú)蒜蘭采自云南玉溪(23.36°N，100.42°E，海拔1 360 m)，大花獨(dú)蒜蘭采自云南文山(23.23°N，104.45°E，海拔1 480 m).

1.2 形態(tài)特征比較

以采集到的流蘇獨(dú)蒜蘭和大花獨(dú)蒜蘭的花瓣為主要形態(tài)學(xué)觀察對(duì)象，解剖花器官，觀察比較花色、萼片、花瓣、唇瓣形狀、唇瓣上的斑點(diǎn)顏色及附屬物形態(tài)，并將流蘇獨(dú)蒜蘭與其疑似親本大花獨(dú)蒜蘭的模式標(biāo)本進(jìn)行花部形態(tài)特征的比較.

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

參照Z(yǔ)hang et al[11]的方法進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、序列的讀取和拼接.PCR擴(kuò)增使用的引物參照Li et al[12]所用引物，利用1個(gè)核糖體基因序列(nrITS)和4個(gè)葉綠體基因片段(matK、trnT-trnL、trnL、trnL-trnF)進(jìn)行引物擴(kuò)增，用于系統(tǒng)發(fā)育分析.

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DNASTAR軟件包中的SeqMan完成DNA序列的編輯和拼接，從GeneBank上獲取獨(dú)蒜蘭屬15種植物相應(yīng)的核基因(nrITS)和葉綠體基因片段(matK、trnT-trnL、trnL、trnL-trnF)(表1)，選擇長(zhǎng)葉足柱蘭和筍蘭作為外類群.

表1 序列數(shù)據(jù)的GenBank登錄號(hào)Table 1 GenBank numbers of sequence data

使用最大似然法(ML)、最大簡(jiǎn)約法(MP)和貝葉斯法(BI)完成系統(tǒng)發(fā)育分析.BI和ML分析使用CIPRES Science Gateway web server (MrBayes on XSEDE 3.2.6和RA×ML-HPC2 on XSEDE 8.1.10)軟件，參數(shù)設(shè)置參照Stamatakis et al[13]的方法；MP分析使用PAUP vertion 4軟件[14].

2 結(jié)果與分析

2.1 流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭的形態(tài)比較

流蘇獨(dú)蒜蘭(圖1A-1C)和大花獨(dú)蒜蘭(圖1D-1F)的背萼片均呈鐮狀倒披針形，側(cè)萼片均傾斜成弓形，呈狹橢圓狀，大花獨(dú)蒜蘭的側(cè)萼片比流蘇獨(dú)蒜蘭略寬.流蘇獨(dú)蒜蘭的花瓣呈狹橢圓狀；大花獨(dú)蒜蘭的花瓣呈倒披針形，二者的唇瓣邊緣均呈撕裂狀，頂端微凹且有4～5條撕裂狀附屬物.流蘇獨(dú)蒜蘭的唇瓣圍繞合蕊柱呈囊狀并在合蕊柱頂端重疊，大花獨(dú)蒜蘭唇瓣不在合蕊柱頂端重疊.流蘇獨(dú)蒜蘭的花為紫紅色，花瓣和萼片基部為灰白色，并著有紋脈，唇瓣展開(kāi)呈倒卵近菱形，喉部白色，分布有深紫色不規(guī)則的斑點(diǎn)和條紋；大花獨(dú)蒜蘭的花為白色，唇瓣展開(kāi)呈寬卵形，白色且分布有黃色斑點(diǎn)和條紋.二者的形態(tài)特征有諸多相似，但花部器官形態(tài)存在差異且花色差異顯著，唇瓣上的斑點(diǎn)及唇瓣形狀、顏色也有不同.

A～C：流蘇獨(dú)蒜蘭(A：植株；B：花瓣解剖結(jié)構(gòu)；C：唇瓣)；D～F：大花獨(dú)蒜蘭(D：植株；E：花瓣解剖結(jié)構(gòu)；F：唇瓣).圖1 流蘇獨(dú)蒜蘭和大花獨(dú)蒜蘭的花部形態(tài)特征Fig.1 Flower morphology of P.barbarae and P.grandiflora

將Braem[9]記載的流蘇獨(dú)蒜蘭形態(tài)與大花獨(dú)蒜蘭模式標(biāo)本進(jìn)行比較(表2)，其形態(tài)差異與本試驗(yàn)采集的流蘇獨(dú)蒜蘭和大花獨(dú)蒜蘭一致.模式標(biāo)本中的流蘇獨(dú)蒜蘭背萼片呈狹橢圓形，大花獨(dú)蒜蘭的背萼片呈倒披針形；二者的側(cè)萼片均呈狹橢圓形且傾斜成弓形；二者的花瓣形狀不同，流蘇獨(dú)蒜蘭的花瓣呈狹橢圓形，大花獨(dú)蒜蘭的花瓣呈鐮狀倒披針形，與本試驗(yàn)采集的材料差異一致；流蘇獨(dú)蒜蘭的唇瓣上有白喉，且圍繞合蕊柱重疊，明顯區(qū)別于大花獨(dú)蒜蘭；二者唇瓣上的附屬物均有5條，且呈撕裂狀；二者的花色明顯不同，流蘇獨(dú)蒜蘭深紫色，大花獨(dú)蒜蘭白色.此外，流蘇獨(dú)蒜蘭地生或巖生，大花獨(dú)蒜蘭巖生.

2.2 核基因序列分析

核基因nrITS序列的總長(zhǎng)度為671 bp，包含53個(gè)信息位點(diǎn)，構(gòu)建核基因片段的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)構(gòu)(圖2)表明，ML、MP和BI樹(shù)中獨(dú)蒜蘭復(fù)合體之間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)支持率低，且流蘇獨(dú)蒜蘭明顯與獨(dú)蒜蘭復(fù)合體分開(kāi)，與大花獨(dú)蒜蘭、艷花獨(dú)蒜蘭、黃花獨(dú)蒜蘭聚為一支，與大花獨(dú)蒜蘭的親緣關(guān)系最近，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的支持率分別為84、66、52，nrITS序列明確將流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭分開(kāi).

表2 流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭模式標(biāo)本形態(tài)特征比較Table 2 Comparison between the holotype of P.barbarae and P.grandiflora

2.3 葉綠體基因序列分析

節(jié)點(diǎn)前的數(shù)字表示BI樹(shù)的后驗(yàn)概率與ML/MP樹(shù)的自展值百分比；/-表示ML、MP和BI樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不一致.圖2 核基因序列的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree inferred from nrITS sequences using Bayesian inference

4個(gè)葉綠體基因片段(matK,trnT-trnL,trnL、trnL-trnF)的總長(zhǎng)度為2 874 bp，包含56個(gè)信息位點(diǎn)，基于此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3).圖3顯示，ML、MP和BI樹(shù)中獨(dú)蒜蘭復(fù)合體之間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的支持率不高，與nrITS序列片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果一致，獨(dú)蒜蘭復(fù)合體聚為一支，與流蘇獨(dú)蒜蘭明顯分開(kāi)，與大花獨(dú)蒜蘭、艷花獨(dú)蒜蘭聚在一起.葉綠體基因序列中，流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭的親緣關(guān)系近且拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的支持率高，分別為100、94、89.

3 討論與結(jié)論

Braem記載描述的P.barbarae形態(tài)特征(表2)為：花大，呈深紫色，花瓣和萼片上無(wú)斑點(diǎn)，唇瓣呈倒卵形，喉部白色，唇瓣上分布有形狀不規(guī)則的微紅色斑塊，中間有4～5條白色的唇瓣附屬物，其中的4條呈明顯的撕裂狀，中間一條僅在頂上部分呈輕微的撕裂狀[9].除唇瓣形狀外，本試驗(yàn)采集的流蘇獨(dú)蒜蘭與Braem描述的P.barbarae形態(tài)特征吻合.經(jīng)查證，Bream記載的線描圖中的唇瓣形狀與本試驗(yàn)采集的流蘇獨(dú)蒜蘭的唇瓣形狀相近，呈倒卵近菱形[9].因此，確定本試驗(yàn)采集的流蘇獨(dú)蒜蘭確系P.barbara.

中國(guó)植物志中大花獨(dú)蒜蘭的形態(tài)特征為：?jiǎn)位?，花大呈白色，唇瓣上時(shí)有分布深紫略紅或棕色的斑點(diǎn)和條紋，還有4～5條不規(guī)則的撕裂褶片，唇瓣呈卵形、橢圓形、扇形，3淺裂[2].本試驗(yàn)采集的大花獨(dú)蒜蘭形態(tài)特征與之吻合.

流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭的花部形態(tài)存在以下不同：流蘇獨(dú)蒜蘭的背萼片呈狹橢圓形，大花獨(dú)蒜蘭的背萼片呈倒披針形；流蘇獨(dú)蒜蘭的花瓣呈狹橢圓形，大花獨(dú)蒜蘭的花瓣呈鐮狀倒披針形；流蘇獨(dú)蒜蘭的唇瓣呈倒卵狀近菱形，唇瓣上有白喉，且圍繞合蕊柱重疊呈囊狀，大花獨(dú)蒜蘭的唇瓣呈寬卵形，圍繞合蕊柱但不重疊；二者的花色明顯不同，流蘇獨(dú)蒜蘭紫紅，大花獨(dú)蒜蘭白色.此外，流蘇獨(dú)蒜蘭地生或巖生，而大花獨(dú)蒜蘭巖生，生態(tài)習(xí)性的不同表明它們對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性也存在差異.

本試驗(yàn)構(gòu)建的兩種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中各分支具有相對(duì)較高的支持率.nrITS和cpDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)構(gòu)均表明，流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭互為姐妹支，同時(shí)，流蘇獨(dú)蒜蘭沒(méi)有與其疑似親本之一的獨(dú)蒜蘭復(fù)合體中任何種聚為一支，否定了獨(dú)蒜蘭復(fù)合體中任何種是流蘇獨(dú)蒜蘭親本之一的猜想.

節(jié)點(diǎn)前的數(shù)字表示BI樹(shù)的后驗(yàn)概率與ML/MP樹(shù)的自展值百分比；/-表示ML、MP和BI樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不一致.圖3 葉綠體基因序列的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree inferred from plastid sequences using Bayesian inference

nrITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的支持率相對(duì)cpDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)低，但nrITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中ML、MP和BI樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致性高，可能因?yàn)樵搶俜只瘯r(shí)間較短，ITS信息位點(diǎn)較少，且大花獨(dú)蒜蘭和流蘇獨(dú)蒜蘭由于分布地存在重疊(模式標(biāo)本均采自云南)，二者可能存在核基因的漸滲，基因之間發(fā)生頻繁交流[15].因此，流蘇獨(dú)蒜蘭和大花獨(dú)蒜蘭表現(xiàn)出形態(tài)特征的相似性，如花大，唇瓣上相同的附屬物形態(tài)及數(shù)量，花亭長(zhǎng)等；二者同分布于云南地區(qū)，同屬春花類獨(dú)蒜蘭，開(kāi)花物候一致，花期4—5月份.對(duì)雜交物種而言，形態(tài)的相似性被認(rèn)為是證明其雜交起源有力的證據(jù)，但雜交后代可能通過(guò)協(xié)同進(jìn)化或回交固定某一親本的序列，從而導(dǎo)致雜交并不總能在分子水平上被鑒別[16].流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭在分子水平上明顯被分開(kāi)，表明流蘇獨(dú)蒜蘭不是天然雜交種.此外，除了早期Braem發(fā)現(xiàn)并命名的P.barbarae標(biāo)本，另有P.moelleriBraem、P.mohriiBraem、P.harberdiiBraem和P.milaniiBraem[9]同被歸并入大花獨(dú)蒜蘭[3].研究者將這些不同變異視作流蘇獨(dú)蒜蘭.由于本試驗(yàn)取材的局限性，確定本試驗(yàn)采集的深紫色花、唇瓣上有白喉且著有深紫色斑點(diǎn)的流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭有很近的親緣關(guān)系，推測(cè)在物種進(jìn)化歷史中流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭可能發(fā)生過(guò)雜交，導(dǎo)致核基因的雙親遺傳與葉綠體母系遺傳不一致[17].結(jié)合nrITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與cpDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的差異，猜測(cè)獨(dú)蒜蘭屬植物很有可能發(fā)生網(wǎng)狀進(jìn)化而導(dǎo)致形態(tài)變異的多樣性.目前尚無(wú)法確定是否存在以大花獨(dú)蒜蘭為親本的天然雜交種，但明確本試驗(yàn)采集的流蘇獨(dú)蒜蘭不是以大花獨(dú)蒜蘭和獨(dú)蒜蘭復(fù)合體之一為親本的天然雜交種.

綜上，本試驗(yàn)采集的流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭的花瓣和唇瓣形狀存在差異，流蘇獨(dú)蒜蘭的唇瓣圍繞合蕊柱重疊明顯區(qū)別于大花獨(dú)蒜蘭，二者的花色存在顯著差異；結(jié)合nrITS和cpDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，排除了大花獨(dú)蒜蘭和獨(dú)蒜蘭復(fù)合體是其親本的可能；確定流蘇獨(dú)蒜蘭與大花獨(dú)蒜蘭的親緣關(guān)系最近，但是否存在以大花獨(dú)蒜蘭為親本的天然雜交種尚需進(jìn)一步驗(yàn)證.本試驗(yàn)初步揭示了大花獨(dú)蒜蘭與流蘇獨(dú)蒜蘭的復(fù)雜關(guān)系，明確流蘇獨(dú)蒜蘭不是一個(gè)天然雜交種，為獨(dú)蒜蘭屬下分類研究提供依據(jù).

致謝：誠(chéng)摯感謝中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所張偉博士為本試驗(yàn)提供材料，福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院江鳴濤博士、劉仲健教授在文章寫作上給予的建議和指導(dǎo).