王 毅, 原曉龍, 陳 偉, 李 江

(云南省林業(yè)科學(xué)院云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

松脂是一類(lèi)復(fù)雜的萜類(lèi)混合物，包括易揮發(fā)的松節(jié)油類(lèi)，主要是單萜和倍半萜類(lèi)以及不易揮發(fā)的松香類(lèi)，主要屬于二萜類(lèi)物質(zhì).目前，從松脂中分離鑒定的化合物已超過(guò)4萬(wàn)種[1].松脂被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、殺蟲(chóng)劑、化工及食品等行業(yè)中.思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)是云南重要的松脂資源樹(shù)種[2]，其松香年產(chǎn)量超過(guò)25萬(wàn)t，松節(jié)油產(chǎn)量超過(guò)6萬(wàn)t.但云南的松脂原料林絕大部分屬于天然次生林，松脂產(chǎn)量低下，平均單株松脂產(chǎn)量?jī)H為2～3 kg·年-1.因此，培育高產(chǎn)脂思茅松種苗成為提高松脂產(chǎn)量的重要手段.目前，對(duì)高產(chǎn)脂思茅松的研究主要集中在優(yōu)樹(shù)選育[3]、半同胞家系選育[4].雖然科研工作者已對(duì)高產(chǎn)脂思茅松優(yōu)樹(shù)產(chǎn)脂量的相關(guān)因子進(jìn)行過(guò)分析，并探討了樹(shù)脂道與高產(chǎn)脂之間的相關(guān)關(guān)系[5-6]，但對(duì)于思茅松高產(chǎn)脂分子機(jī)理的研究卻未見(jiàn)報(bào)道.

植物萜類(lèi)物質(zhì)的合成是由甲羥戊酸途徑(MVA)和2C-甲基4-磷酸-4D-赤蘚糖醇途徑(MEP)兩個(gè)途徑完成，其中，單萜和二萜主要由MEP途徑合成，倍半萜類(lèi)主要由MVA途徑合成[7].無(wú)論是MVA途徑還是MEP途徑，都會(huì)合成異戊烯焦磷酸及其異構(gòu)物二甲丙烯焦磷酸，然后由于其在植物細(xì)胞中的不同位置，最終形成不同的代謝終產(chǎn)物[8].牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase, GGPS)主要利用來(lái)源于MEP途徑合成的異戊烯焦磷酸及其異構(gòu)物二甲丙烯焦磷酸、牻牛兒基焦磷酸等底物聚合形成合成二萜、四萜及多萜化合物的前體——牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)[9].Ignea et al[10]研究表明，在酵母中，超表達(dá)GGPS基因能夠有效提高菌株二萜的產(chǎn)量；國(guó)內(nèi)研究人員也發(fā)現(xiàn)，GGPS與馬尾松的產(chǎn)脂力密切相關(guān)[11].因此，GGPS是植物二萜類(lèi)化合物生物合成的關(guān)鍵酶之一.而松脂中不揮發(fā)的主要成分——松香類(lèi)物質(zhì)主要屬于二萜類(lèi)物質(zhì).目前，雖然已從多種植物中克隆獲得GGPS基因，如曼地亞紅豆杉[12]、雷公藤[13]、巴夫杜氏藻[14]、馬尾松[15]、茶樹(shù)[16]等，但尚未見(jiàn)思茅松GGPS基因的相關(guān)報(bào)道.本試驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得思茅松GGPS基因序列，并采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得該基因，同時(shí)對(duì)GGPS基因在不同思茅松個(gè)體及組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析.這些研究將有助于揭示思茅松高產(chǎn)脂的分子機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 材料

供試高產(chǎn)脂思茅松種植在云南景洪普文鎮(zhèn)普文試驗(yàn)林場(chǎng).選擇年產(chǎn)脂量高于30 kg的高產(chǎn)脂思茅松優(yōu)樹(shù)用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，同時(shí)選擇產(chǎn)脂量低于0.5 kg的植株作為低產(chǎn)脂個(gè)體，與高產(chǎn)脂思茅松個(gè)體用于基因表達(dá)量的分析.采集高、低產(chǎn)脂思茅松的不同組織樣品并放入液氮中保存.

1.2 轉(zhuǎn)錄組分析

將高、低產(chǎn)脂思茅松的樹(shù)皮組織送到深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)序列進(jìn)行組織拼接后，通過(guò)以馬尾松GGPS蛋白序列對(duì)轉(zhuǎn)錄組Unigene進(jìn)行本地Blast，尋找高產(chǎn)脂思茅松樹(shù)皮轉(zhuǎn)錄組中的GGPS基因；同時(shí)，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的Unigene分別注釋到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，并對(duì)注釋結(jié)果中的GGPS基因進(jìn)行分析.

1.3 RNA的提取

分別提取高、低產(chǎn)脂思茅松個(gè)體的松針以及小枝的RNA，并且以割脂后0、6、12 h為時(shí)間梯度采集割脂處的樹(shù)皮等組織，提取RNA.具體提取方法如下：在液氮環(huán)境中，將樣品用組織研磨儀打成粉末后，采用CTAB裂解，使用LiCl沉淀法、膜上消化的方式去除樣品中的DNA[17]，分別提取每個(gè)樣品的RNA后，用1%瓊脂膠檢測(cè)RNA的完整性,并用分光光度計(jì)測(cè)量各樣品RNA在260、280、320、230 nm波長(zhǎng)處的光密度(D)，確定其純度.分別取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.將樣品cDNA保存在冰箱(-20 ℃)中備用.

1.4 GGPS基因的克隆

通過(guò)對(duì)高產(chǎn)脂思茅松樹(shù)皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得表達(dá)量高的GGPS基因序列.以獲得的GGPS基因序列,設(shè)計(jì)含有起始密碼子的特異引物(PkGGPSF:5′-ATGGCTTACAGTGCCATGGC-3′)和含有終止密碼子的特異引物(PkGGPSR: 5′-TCAGTTTTGTCTTTGTG-3′).以高產(chǎn)脂思茅松樹(shù)皮的cDNA為模板，用LA-Taq高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后將目的片段連接到pClone007載體上，并轉(zhuǎn)入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌落PCR篩選出陽(yáng)性克隆，送上海生工測(cè)序公司測(cè)序，最終通過(guò)序列比對(duì)確定獲得GGPS基因全長(zhǎng)片段，并永久保存在冰箱(-80 ℃)中.

1.5 GGPS基因克隆及蛋白生物信息學(xué)分析

采用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的在線軟件ORFFinder對(duì)思茅松GGPS基因進(jìn)行蛋白翻譯后，用在線軟件ProtParam對(duì)GGPS蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，GGPS保守結(jié)構(gòu)域分析由在線蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析軟件完成，其氨基酸同源序列比對(duì)則用DNAMAN 軟件完成，最終確定GGPS的保守結(jié)構(gòu)域.將思茅松GGPS蛋白與NCBI已知其他植物的GGPS蛋白進(jìn)行多重比對(duì)后，用MEGA7軟件中的鄰位相連法程序進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析.

1.6 GGPS基因不同組織的表達(dá)分析

分別取2 μg高、低產(chǎn)脂思茅松個(gè)體的不同組織RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一條鏈.以不同組織的cDNA為模板，用特異引物TPkGGPSF(5′-CACTTGCTCAGACATCTT-3′)和TPkGGPSR(5′-CTATCCTCAACCGTTCAG-3′)進(jìn)行熒光定量PCR分析，并以阿爾法延長(zhǎng)因子基因作為內(nèi)參基因.具體反應(yīng)體系如下：分別向PCR管中加入12.5 μL 2×SYBR Green master mix(含ROX)、引物TPkGGPSF和TPkGGPSR各0.5 μL、1 μL cDNA,最后用超純水補(bǔ)足至25 μL.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s；60 ℃退火、延伸30 s，共40個(gè)循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后，收集信息做循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold, Ct)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組分析

表1 轉(zhuǎn)錄組分析得到的GGPS信息Table 1 Information of GGPS by transcriptome analysis

采用Illumina Hiseq 2000平臺(tái)對(duì)高、低產(chǎn)脂思茅松割脂后傷口附近的樹(shù)皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總計(jì)產(chǎn)出5 828 966 460 nt數(shù)據(jù)，組裝結(jié)果得到59 636個(gè)Unigene.對(duì)所獲得的Unigene進(jìn)行本地Blast，并在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，最終獲得13個(gè)可能的GGPS基因片段(表1).根據(jù)已知其他植物GGPS基因的大小在1 000 bp以上，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中最終得到大于1 000 bp的GGPS基因片段有2個(gè).通過(guò)蛋白序列分析以及表達(dá)量分析最后確定Unigene9201(表1)作為后續(xù)克隆分析的對(duì)象.

2.2 RNA提取與基因克隆

高、低產(chǎn)脂思茅松個(gè)體的不同組織樣品經(jīng)過(guò)液氮磨碎后，采用優(yōu)化后的CTAB法提取各樣品的RNA，電泳檢測(cè)顯示所提取的RNA完整性較好(圖1).各樣品的D260 nm/D280 nm均為1.8～2.1，說(shuō)明RNA純度較高，適合于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn).

1～5：高產(chǎn)脂思茅松(1：樹(shù)皮；2:割脂6 h后的樹(shù)皮；3:割脂12 h后的樹(shù)皮；4:小枝;5:松針)；6～10:低產(chǎn)脂思茅松(6：樹(shù)皮；7:割脂6 h后的樹(shù)皮；8:割脂12 h后的樹(shù)皮；9:小枝；10:松針)；M：Trans2K DNA ladder.圖1 RNA電泳檢測(cè)圖Fig.1 Electrophoretogram of RNA

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的GGPS基因片段序列的特異引物(PkGGPSF、PkGGPSR)，以PkGGPSF、PkGGPSR為引物，高產(chǎn)脂思茅松樹(shù)皮cDNA為模板，進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出來(lái)的目的片段連接到克隆載體中，并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證，最終獲得1 152 bpGGPS基因編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA.

2.3 GGPS蛋白序列分析

將獲得的思茅松GGPS基因序列采用在線ORF以及ProtParam軟件進(jìn)行蛋白序列分析，結(jié)果顯示，思茅松GGPS基因共編碼383個(gè)氨基酸，其分子質(zhì)量為41.66 ku，等電點(diǎn)為7.58.利用NCBI上的在線結(jié)構(gòu)域分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)以及DNAman軟件對(duì)與思茅松GGPS親緣關(guān)系近的其他植物GGPS蛋白進(jìn)行序列比對(duì)(圖2)，確定思茅松GGPS擁有GGPS所特有的兩個(gè)功能區(qū)域FARM(DDLPSMDND)、SARM (DDILD)[18].思茅松GGPS與馬尾松GGPS的蛋白序列同源性為78.07%,與挪威云杉GGPS的同源性為70.62%，與巨冷杉GGPS的同源性為68.56%.

Pk:思茅松GGPS;Pm：馬尾松GGPS(登錄號(hào)：AGU43761.1);Pa:挪威云杉GGPS(登錄號(hào)：ACA21458.2);Ag:巨冷杉GGPS(登錄號(hào)：AAN01134.1).黃色部分為FARM功能區(qū)，綠色部分為SARM功能區(qū).圖2 GGPS蛋白序列比對(duì)Fig.2 Alignment of GGPS protein sequence

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將推導(dǎo)出來(lái)的思茅松GGPS蛋白序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，獲得其他植物GGPS蛋白序列.采用MEGA7軟件中自帶的ClusterW程序進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)后，用鄰位相連法(各分支置信度由自檢舉分析1 000次)繪制出思茅松GGPS與其他植物GGPS蛋白的進(jìn)化樹(shù)(圖3).從圖3可以看出，GGPS在裸子植物和被子植物中明顯分為兩支.在裸子植物中，思茅松的GGPS與冷杉、云杉以及松科植物聚為亞枝，其中，思茅松GGPS與馬尾松GGPS的親緣關(guān)系最近.

2.5 GGPS基因在不同組織中的表達(dá)

為了解GGPS基因在思茅松不同組織以及不同個(gè)體之間的表達(dá)差異，以特異引物TPkGGPSF、TPkGGPSR，采用熒光定量PCR檢測(cè)GGPS基因在不同樣品中的表達(dá)情況.結(jié)果(圖4)顯示：GGPS基因在高產(chǎn)脂思茅松個(gè)體(產(chǎn)脂量>30 kg·年-1)的不同組織中，小枝中的表達(dá)量最高，松針中的表達(dá)量次之，割脂后樹(shù)皮中的表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì)；GGPS基因在低產(chǎn)脂思茅松個(gè)體(產(chǎn)脂量<0.5 kg·年-1)的不同組織中，松針中的表達(dá)量比小枝中的表達(dá)量高，割脂后樹(shù)皮中的表達(dá)量隨著時(shí)間變化而逐漸升高，割脂12 h后達(dá)到最高值.

圖3 思茅松GGPS與其他植物GGPS的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree analysis of GGPS from P.kesiya and other species

HB0:高產(chǎn)脂思茅松樹(shù)皮；HB6:高產(chǎn)脂思茅松割脂6 h后的樹(shù)皮；HB12:高產(chǎn)脂思茅松割脂12 h后的樹(shù)皮；HS:高產(chǎn)脂思茅松小枝;HN:高產(chǎn)脂思茅松松針；LB0:低產(chǎn)脂思茅松樹(shù)皮；LB6:低產(chǎn)脂思茅松割脂6 h后的樹(shù)皮；LB12:低產(chǎn)脂思茅松割脂12 h后的樹(shù)皮；LS:低產(chǎn)脂思茅松小枝；LN:低產(chǎn)脂思茅松松針.圖4 思茅松GGPS基因的表達(dá)量Fig.4 Gene expression profile of GGPS from P.kesiya

3 討論

松香是松脂中不易揮發(fā)的部分，主要屬于二萜類(lèi)物質(zhì)，約占松脂總量的四分之三[19-20].思茅松是云南重要的松脂資源樹(shù)種，目前已有研究人員開(kāi)展高松香思茅松無(wú)性系的選育[21]，但傳統(tǒng)的選育方法對(duì)于生長(zhǎng)周期漫長(zhǎng)的思茅松面臨著選育周期長(zhǎng)的問(wèn)題.隨著分子輔助育種的發(fā)展，目前已研發(fā)出多種松科植物的分子標(biāo)記，但尚未見(jiàn)與性狀有效關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記的報(bào)道.從報(bào)道的其他植物與數(shù)量性狀遺傳相關(guān)的分子標(biāo)記可以發(fā)現(xiàn)，許多研發(fā)出來(lái)的分子標(biāo)記往往位于與相關(guān)性狀代謝途徑相關(guān)的基因座區(qū)域內(nèi)[22-24].這或許為研發(fā)高產(chǎn)脂思茅松分子標(biāo)記提供了新思路：從性狀相關(guān)代謝途徑的基因入手，通過(guò)單核苷酸多態(tài)性尋找與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記或許是一種比傳統(tǒng)分子標(biāo)記更有效的方法.

GGPS是植物中二萜、四萜以及多萜類(lèi)化合物合成的關(guān)鍵酶，松脂中的主要成分——松香類(lèi)化合物就屬于二萜類(lèi)化合物.本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)高產(chǎn)脂思茅松割脂后樹(shù)皮的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，獲得GGPS基因序列，然后利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得GGPS基因.思茅松GGPS基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1 152 bp,編碼383個(gè)氨基酸.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，思茅松GGPS與馬尾松GGPS聚為一支，但思茅松GGPS與馬尾松GGPS的同源性只有78.07%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于思茅松松脂代謝途徑中其他酶與松科植物相關(guān)酶的同源性，如思茅松HDR、DXS蛋白與赤松(Pinusdensiflora) HDR、DXS蛋白的同源性高達(dá)99%[17,25]，這說(shuō)明GGPS相比松脂代謝途徑中的其他酶具有更大的變異性.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析還顯示：松屬植物GGPS與冷杉屬、云杉屬植物GGPS的親緣關(guān)系近，而與紅豆杉屬、三尖杉屬植物的親緣關(guān)系遠(yuǎn).從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也可以看出，被子植物與裸子植物在GGPS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上明顯分為兩枝.

熒光定量PCR分析顯示，思茅松GGPS基因在樹(shù)皮中的表達(dá)量明顯受到割脂物理傷害的刺激，表明思茅松GGPS基因與松脂合成相關(guān)，但不同個(gè)體受物理傷害刺激的程度和時(shí)間不一樣.低產(chǎn)生思茅松受到割脂刺激后，GGPS基因高表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)(刺激后12 h)明顯比高產(chǎn)脂思茅松個(gè)體的高表達(dá)量時(shí)間點(diǎn)(刺激后6 h)晚.高、低產(chǎn)脂思茅松個(gè)體GGPS基因表達(dá)量差異最大的是在幼枝中，GGPS基因在高產(chǎn)脂思茅松幼枝中的表達(dá)量比在低產(chǎn)脂的高約40倍.在不同組織的比較中，思茅松GGPS基因的表達(dá)量也是在高產(chǎn)脂幼枝中最高.這說(shuō)明思茅松割脂獲得的松脂可能主要來(lái)源于原生樹(shù)脂道，而原生樹(shù)脂道的松脂主要是在幼枝中合成，然后進(jìn)行從上而下的運(yùn)輸，從而有效地防御蟲(chóng)害以及物理傷害.基因表達(dá)分析結(jié)果可以明確，GGPS基因的表達(dá)量與思茅松產(chǎn)脂量呈正相關(guān).若最終能夠找到DNA水平上的差異與GGPS基因表達(dá)量的差異呈正相關(guān)，那么就有可能開(kāi)發(fā)出與高產(chǎn)脂思茅松產(chǎn)脂緊密連鎖的分子標(biāo)記.