龍 瑩, 嚴(yán)俊杰, 仝宗軍, 劉媛媛, 苗 娟, 陶永新, 江玉姬, 謝寶貴

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002)

真菌細(xì)胞壁的成分主要是多糖(β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖、幾丁質(zhì)和甘露糖)和糖蛋白[1,2].β-葡聚糖是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的主要多糖，位于細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)，占細(xì)胞干重的40%～50%，主要是以β-1,3-糖苷鍵為主鏈，β-1,6-糖苷鍵為支鏈的多糖分子，其特殊的結(jié)構(gòu)有助于激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)[3,4,5].Wessels[6]曾提到真菌細(xì)胞壁的擴(kuò)張包括多糖的合成與水解.β-1,6-葡聚糖合酶(β-1, 6-Glucan Synthase)是合成β-1,6-葡聚糖的關(guān)鍵基因，可能在細(xì)胞壁擴(kuò)張過程中發(fā)揮著重要作用.Kottom et al[7]研究表明，β-1,6-葡聚糖合酶抑制劑能使卡氏肺孢子蟲(Pneumocystiscarinii)中β-1,6-葡聚糖的產(chǎn)量降低；促進(jìn)卡氏肺孢子蟲編碼β-1,6-葡聚糖合酶基因Pckre6 在kre6缺陷型釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達(dá)，恢復(fù)了釀酒酵母細(xì)胞壁的完整性，推測β-1,6-葡聚糖合酶通過參與β-1,6-葡聚糖的合成，影響細(xì)胞壁合成.

金針菇(Flammulinavelutipes)味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有降血脂、降膽固醇、抗癌等功能，具有較高的食用價值和藥用價值，在國際市場上被譽(yù)為“超級保健食品”[8,9].金針菇菌柄是主要食用部分，研究金針菇菌柄伸長生長機(jī)制有助于在生產(chǎn)過程中更好地控制生產(chǎn)條件，提高金針菇產(chǎn)量，帶來更多的經(jīng)濟(jì)價值.Wong et al[10]研究表明，金針菇菌柄伸長時，伴隨著細(xì)胞伸長，菌柄細(xì)胞數(shù)量較原基增多，且在快速伸長階段細(xì)胞數(shù)量至少增加了40%.Kamada et al[11,12]研究表明，在長根鬼傘(Coprinusmacrorhizus)菌柄細(xì)胞伸長過程中，細(xì)胞壁組分的變化與菌柄伸長是平行的，其中多糖組分也會相應(yīng)地變化.Kamada et al[13]在研究灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)菌柄伸長時發(fā)現(xiàn)由β-(1→3)和β-(1→6)兩種鍵型構(gòu)成的葡聚糖組分Ⅲ的分子量顯著增加.傘菌菌柄伸長過程與涉及到細(xì)胞壁多糖的合成及降解的酶類有關(guān)，如β-葡聚糖酶類、幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)合酶等[14].酶與食用菌子實(shí)體形態(tài)發(fā)育密切相關(guān)，多糖組分變化過程中涉及酶類的作用機(jī)制研究尚未成熟[15].金針菇菌柄細(xì)長且伸長速度快的特征是研究傘菌菌柄細(xì)胞壁合成、細(xì)胞伸長的較好材料.

本研究根據(jù)金針菇基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得到與金針菇菌柄伸長相關(guān)的β-1,6-葡聚糖合酶編碼基因fv-gs6的序列信息，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步探究了其在金針菇子實(shí)體不同組織及生長發(fā)育階段的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)fv-gs6在菌柄上高表達(dá)，且在伸長期菌柄表達(dá)量最高，以期為進(jìn)一步研究酶類對細(xì)胞壁合成、細(xì)胞伸長的作用機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金針菇單核菌株Fv01-10以及雙核菌株Fv01均由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供.Fv01是由Fv01-10和Fv01-N配對獲得的雙核菌株.

1.2 基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

金針菇單核菌株Fv01-10基因組、金針菇雙核菌株Fv01不同生長發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供.

1.3 樣品處理及采集

分別采集Fv01子實(shí)體原基期、伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄及成熟期菌蓋，每個樣品收集5個生物學(xué)重復(fù).選擇處于伸長期的菌柄(柄長約為12 cm)，采集菌蓋下方0.6～1.5 cm伸長區(qū)間及6～7 cm區(qū)間的不伸長區(qū)段樣品，每個樣品5個生物學(xué)重復(fù).將收集的樣品置于錫箔紙中做好標(biāo)記后迅速放入液氮中保存?zhèn)溆?

1.4 fv-gs6基因準(zhǔn)確性驗(yàn)證及結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)金針菇Fv01-10基因組數(shù)據(jù)得到fv-gs6基因序列，基因準(zhǔn)確性驗(yàn)證參照嚴(yán)俊杰等[16]的方法，以基因序列及上下游各500 bp為參考序列，采用Zoom lite軟件[17]將Fv01-10基因組測序所得reads庫對參考序列進(jìn)行定位(相鄰paired reads距離設(shè)置為1～1 000 bp， 錯配堿基數(shù)設(shè)置為0).

在基因序列上下游各延伸2 kb作為參考序列，參照Yan et al[18]的方法，用金針菇Fv01不同生長發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對目的基因及其上下游序列使用Zoom lite軟件進(jìn)行定位(錯配堿基數(shù)設(shè)置為40)，分析其基因結(jié)構(gòu)信息.使用在線基因結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建系統(tǒng)GSDS(genestructure display sever,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制fv-gs6的基因結(jié)構(gòu)圖譜.

1.5 Fv-GS6蛋白生物信息學(xué)分析

蛋白結(jié)構(gòu)域分析采用在線分析軟件InterProScan5 (http:// www. ebi. ac. uk/ Tools/ pfa/ iprscan5/)；Fv-GS6及其它真菌中的同源蛋白的基序(Motif)分析采用在線軟件MEME (http://meme.sdsc.edu/meme/cgibin/meme.cgi；參數(shù)設(shè)置為:number of different motifs 12; minimum number of sites 2；maximum number of sites 10; minimum motif width 10; maximum motif width 100;P<1×10-10) ；蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測與分析采用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析采用TMHMM程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位采用softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)；在UniProt網(wǎng)站上篩選下載Fv-GS6的同源序列，采用MEGA6軟件包[19](參數(shù)為bootstrap values 1000 resamplings)構(gòu)建相應(yīng)序列的鄰接法(Neighbor-Joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.6 fv-gs6表達(dá)量分析

采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，美國)提取樣品總RNA，采用TaKaRa PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa Bio Group，日本)合成cDNA.實(shí)時熒光定量PCR采用試劑BIO-RAD iTaq TM Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad，美國)，在實(shí)時熒光定量 PCR儀(Bio-Rad CFX96，美國) 上進(jìn)行.實(shí)時熒光定量反應(yīng)體系及程序參考所使用試劑盒的說明書.目標(biāo)基因的相對表達(dá)量使用2-△△CT法進(jìn)行計算處理.以金針菇Fv01-10甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼基因(GAPDH)為內(nèi)參基因，引物序列如表1所示.

表1 實(shí)時熒光定量的引物序列Table 1 Primer sequence of quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 fv-gs6基因序列準(zhǔn)確性驗(yàn)證及結(jié)構(gòu)分析

圖1 基因組Reads在fv-gs6序列上的定位情況Fig.1 Positioning of genomic reads on fv-gs6 sequence

Zoom lite軟件reads定位結(jié)果(圖1)顯示fv-gs6基因序列均有Fv01-10基因組reads覆蓋，且最低覆蓋的reads條數(shù)為54條，說明該基因的序列準(zhǔn)確可信.

子實(shí)體不同生長發(fā)育階段及不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過Zoom lite軟件reads定位表明，fv-gs6全長1 439 bp，含有9個外顯子，8個內(nèi)含子(圖2)，編碼339個氨基酸.此結(jié)果符合“GT-AG”內(nèi)含子剪切位置的原則.fv-gs6核酸序列信息已提交至Genbank，基因登錄號為MF457899.將該基因序列與Fv01-10基因組進(jìn)行本地Blast，發(fā)現(xiàn)該序列僅定位到scaffold1上，位于3 610 934至3 609 496之間，推測其為單拷貝基因.

圖2 fv-gs6基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of fv-gs6

2.2 Fv-GS6蛋白的生物信息學(xué)分析

Fv-GS6的結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果(圖3)表明該蛋白屬于糖苷水解酶家族(IPR017853).通過在UniProt網(wǎng)站上篩選下載雙孢蘑菇(Agaricusbisporus, Q9P8B3)等9種真菌β-1,6-葡聚糖合酶氨基酸序列進(jìn)行基序分析，結(jié)果顯示β-1,6-葡聚糖合酶基序可以分為子囊菌和擔(dān)子菌兩大類，金針菇屬于擔(dān)子菌，其Fv-GS6基序歸屬于擔(dān)子菌、并且與雙孢蘑菇相似，支持金針菇Fv-GS6屬于β-1,6-葡聚糖合酶的推測(圖4).

圖3 Fv-GS6蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.3 Protein domain of Fv-GS6

1至5:Pochonia chlamydosporia (A0A179FS78), Metarhizium anisopliae (A0A0B4GPK3), Isaria fumosorosea (A0A167PLB3), Cordyceps confragosa (A0A168BJH5), Hypocrea jecorina (A0A024S1Z0). 6至10:Agaricus bisporus (Q9P8B3), Mycena chlorophos (A0A146HY51), Moniliophthora roreri (V2XTE5), Fv-GS6, Coprinopsis cinerea (A8NUV7).圖4 Fv-GS6和其它真菌中同源蛋白β-1,6-葡聚糖合酶的基序分析Fig.4 Motifs of Fv-GS6 and other fungal β-1, 6-glucan synthase homology proteins

利用在線軟件對fv-gs6編碼的蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白具有信號肽(圖5A)，預(yù)示著該蛋白可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑，且通過信號肽切割位點(diǎn)剪切信號肽形成成熟的蛋白質(zhì)，屬于分泌型蛋白；亞細(xì)胞定位結(jié)果(圖5B)也支持該蛋白位于細(xì)胞外.另外，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示Fv-GS6蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白(圖5C).

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過在UniProt網(wǎng)站上篩選下載雙孢蘑菇(Agaricusbisporus, Q9P8B3)、灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea, A8NUV7)、豆薯層銹菌(Phakopsorapachyrhizi, A0A0S1MIW1)、紅褐肉座菌 (Hypocreajecorina, A0A024S1Z0)等12個物種的β-1,6-葡聚糖合酶氨基酸序列，用MEGA6軟件包構(gòu)建鄰接法(Neighbor-Joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹.結(jié)果(圖6)顯示擔(dān)子菌和子囊菌的β-1,6-葡聚糖合酶分別聚在兩個大分支上，擔(dān)子菌這一大分支中又可以分為兩小類，金針菇中的Fv-GS6蛋白與雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)聚在同一小分支上.Fv-GS6蛋白歸屬于擔(dān)子菌這一分支，它與基序的分析結(jié)果相一致.

A為Fv-GS6信號肽預(yù)測結(jié)果；B為Fv-GS6亞細(xì)胞定位結(jié)果；C為Fv-GS6跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果.圖5 Fv-GS6信號肽(A)、亞細(xì)胞定位(B)及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(C)結(jié)果Fig.5 Signal peptide (A), subcellular localization (B) and transmembrane structure prediction (C) of Fv-GS6

圖6 Fv-GS6系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析Fig.6 Phylogeny analysis of Fv-GS6

2.4 fv-gs6在金針菇子實(shí)體各個生長發(fā)育階段表達(dá)量檢測

fv-gs6的qRT-PCR結(jié)果(圖7A)顯示：以原基時期的表達(dá)量為對照，fv-gs6在伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄、成熟期菌蓋的表達(dá)量分別是原基的97.94倍、0.38倍、64.15倍、0.08倍.在金針菇子實(shí)體生長發(fā)育階段，fv-gs6在菌柄的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在其它組織或發(fā)育階段的表達(dá)量，且在伸長期菌柄的表達(dá)量高于在成熟期菌柄的表達(dá)量，該結(jié)果說明fv-gs6可能在伸長期菌柄中發(fā)揮著比較重要的作用.對fv-gs6在金針菇菌柄伸長區(qū)段與非伸長區(qū)段的表達(dá)量進(jìn)行檢測，qRT-PCR結(jié)果(圖7B)顯示fv-gs6在菌柄伸長區(qū)段的表達(dá)量是不伸長區(qū)段的5.42倍.結(jié)果表明fv-gs6的表達(dá)量與金針菇菌柄伸長速度呈正相關(guān).

A為fv-gs6在金針菇子實(shí)體各個生長發(fā)育階段表達(dá)量；B為fv-gs6在金針菇菌柄不同伸長區(qū)段的表達(dá)量prm：原基，eln-stp：伸長期菌柄，eln-pls：伸長期菌蓋，mtr-stp：成熟期菌柄，mtr-pls：成熟期菌蓋，stp-eln：菌柄伸長區(qū)段，stp-sta：菌柄非伸長區(qū)段.圖7 fv-gs6在金針菇子實(shí)體中的表達(dá)量Fig7 Relative expression level of fv-gs6 in F.velutipes fruit body

3 討論

Humbel et al[20]通過抗體標(biāo)記等方法，在釀酒酵母的高爾基體、小囊泡、細(xì)胞膜底層檢測到了β-1,6-葡聚糖的存在，推測β-1,6-葡聚糖的合成始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，途經(jīng)高爾基體，最后定位于細(xì)胞表面.本研究對Fv-GS6蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位的分析顯示該蛋白具備完整的信號肽，且亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示在細(xì)胞外，可以被分泌到細(xì)胞外合成并行使催化功能.有研究表明[20]，僅有少量的β-1,6-葡聚糖定位在細(xì)胞內(nèi)，而絕大多數(shù)分布于細(xì)胞膜外；Montijn et al[21]的研究結(jié)果也顯示β-1,6-葡聚糖的合成大部分發(fā)生在細(xì)胞表面.據(jù)此推測：β-1,6-葡聚糖可能大部分在細(xì)胞外合成并直接用于組成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，僅有少部分在細(xì)胞內(nèi)合成并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)——高爾基體途徑被分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用.

Gilbert et al[22]研究發(fā)現(xiàn)在新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)中，KRE(killer toxin resistant)家族的KRE5、KRE6與β-1,6-葡聚糖合成相關(guān)，具有維持細(xì)胞壁完整性等作用，在這些基因突變株中發(fā)現(xiàn)β-1,6-葡聚糖含量減少、生長速度減慢且表型異常.Mol et al[23]研究雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)時發(fā)現(xiàn)在菌柄快速伸長階段β-葡聚糖中由β-1,6-糖苷鍵連接的葡聚糖側(cè)鏈比重增加.Eastwood et al[24]研究表明，在雙孢蘑菇采收后，β-1,6-葡聚糖合酶的編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平仍有所提高，Braaksma et al[25]研究表明，在雙孢蘑菇后熟階段菌柄、菌蓋、菌褶都有生長，推測β-1,6-葡聚糖合酶可能影響細(xì)胞壁成分變化.本研究結(jié)果顯示，fv-gs6在金針菇菌柄中高表達(dá)，在伸長期菌柄的表達(dá)量高于成熟期菌柄的表達(dá)量，且在菌柄伸長區(qū)段的表達(dá)量高于非伸長區(qū)段的表達(dá)量；推測該基因的高表達(dá)可以提高菌柄細(xì)胞β-1,6-葡聚糖的合成量，增加細(xì)胞壁合成速度，從而促進(jìn)菌柄伸長.

致謝：國家食用菌品種改良中心福建分中心、福建省食用菌工程技術(shù)研究中心為本研究提供了試驗(yàn)與分析條件，在此表示感謝!