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      桑黃不同提取物對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響

      2018-12-19 08:46:52萬鳳楊汝春時延朋張華琴
      浙江臨床醫(yī)學(xué) 2018年10期
      關(guān)鍵詞:桑黃腎小管抑制率

      萬鳳 楊汝春? 時延朋 張華琴

      腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)是各種慢性腎臟?。–KD)進(jìn)展至終末期腎病(ESRD)的共同通路和主要病理特征[1]。研究發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)是TIF發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[2]。EMT受多種生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),其中最重要的是轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)。實(shí)驗表明TGF-β1參與多數(shù)腎臟病中進(jìn)展性腎纖維化的病理形成[3]。目前,有關(guān)桑黃提取物在腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生中的作用研究尚未見報道。因此,本文以大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞為研究對象,觀察桑黃PA、PW和PP對TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞EMT的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料 (1)細(xì)胞株:大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E,購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫,細(xì)胞系目錄號GNR 8。(2)藥物與試劑:PA、PW和PP均由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。胎牛血清(Gibco),DMEM低糖培養(yǎng)基,0.25%胰酶-EDTA,雙抗、CCK-8試劑盒均購自杭州達(dá)文生物有限公司;RT-PCR引物由上海生工生物有限公司合成。TGF-β1(R&D公司),TRIzol reagent(Invitrogen),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM均自TaKaRa公司。

      1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和0.1g/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),進(jìn)行換液1次/1~2d。當(dāng)細(xì)胞生長融合至80%~90%融合時,用含0.25%胰酶-EDTA溶液進(jìn)行消化細(xì)胞,吹打均勻并傳代。

      1.3 CCK-8法測定NRK-52E細(xì)胞存活率 消化收集對數(shù)增殖期NRK-52E細(xì)胞并以1×108/L的密度接種于96孔板,每孔100μl,細(xì)胞貼壁后用無血清培養(yǎng)基同步化24h。之后實(shí)驗組分別加入不同濃度的采用含2%FBS DMEM培養(yǎng)基配制的倍比稀釋的PA、PW和PP,每孔100μl,終濃度分別為1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和 400μg/ml,對照組加入等體積2% DMEM培養(yǎng)基,每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后每孔加入10μl CCK-8 溶液,37℃反應(yīng)2h后于450nm波長處檢測每孔吸光度值。細(xì)胞生存率及增殖抑制率按如下公式計算:生存率(%)=(實(shí)驗組OD值/對照組OD)×100%。抑制率(%)=(1-生存率)×100%。

      1.4 實(shí)驗分組 將NRK-52E接種在6孔板中,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時進(jìn)行無血清同步化處理24h,之后將NRK-52E細(xì)胞隨機(jī)分為5組:(1)對照組。(2)誘導(dǎo)組:只添加10ng/mlTGF-β1。(3)PA干預(yù)組:10ng/ml TGF-β1+100μg/ml PA。(4)PW干預(yù)組:10 ng/ml TGF-β1+200μg/ml PW。(5)PP干預(yù)組:10ng/ml TGF-β1+200 μg/ml PW。

      1.5 RT-PCR檢測EMT相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá) PA、PW和PP分別處理NRK-52E 24 h,收集細(xì)胞,TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA,分光光度計測定RNA濃度。取所提取的2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并進(jìn)行熒光定量PCR,GAPDH作為內(nèi)參。E-cadherin的上游引物:AACAACTGCATGAAGGCGATCTCC,下游引物TTGACCACCGTTCTCCTCCGTAG,擴(kuò)增產(chǎn)物長度137bp;α-SMA的上游引物:GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC,下 游 引 物:CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC, 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為150bp;Desmin的上游引物:AATGACCGCTTCGCCAACTACTTC, 下 游 引 物:GCTCTCGCATCTCCTCCTCGTAG,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為139 bp;GAPDH的上游引物:ACCACAGTCCATGCCATCAC,下游引物:TCCACCACCCTGTTGCTGTA,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為453 bp。

      1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以()表示,方差齊者,多組間采用one-way ANOVA,組間兩兩比較用LSD法;如方差不齊,采用Tamhane's T2。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 PA對NRK-52E細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示,與對照組比較,低濃度的PA對NRK-52E細(xì)胞無明顯的抑制作用,當(dāng)濃度達(dá)到200μg/ml時,PA可顯著抑制NRK-52E的增殖效應(yīng),抑制率達(dá)到56%,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)PA濃度達(dá)到400μg/ml時,其對NRK-52的抑制率高達(dá)68%,較對照組差異性顯著(P<0.01)。

      2.2 PW對NRK-52E細(xì)胞的增殖效應(yīng) CCK-8結(jié)果顯示,與對照組比較,低濃度的PW對NRK-52E細(xì)胞無明顯的抑制作用,當(dāng)濃度達(dá)到400μg/ml時,PW可顯著抑制NRK-52E的增殖作用,抑制率達(dá)到50%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

      2.3 PP對NRK-52E細(xì)胞的增殖效應(yīng) CCK-8結(jié)果顯示,與對照組比較,低濃度的PP對NRK-52E細(xì)胞無明顯的增殖效應(yīng),當(dāng)濃度達(dá)到12.5μg/ml和25μg/ml時,其增殖率分別達(dá)到175%和176%,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。然而,隨著濃度的繼續(xù)增加,其增殖作用趨于減弱。當(dāng)濃度達(dá)到400μg/ml時,PP反而抑制NRK-52E的增殖效應(yīng),抑制率達(dá)到38%(P<0.05)。

      2.4 桑黃不同濃度提取物對NRK-52E細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 基于CCK-8結(jié)果,分別選取100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP用于后續(xù)的EMT干預(yù)實(shí)驗。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)組中α-SMA和desmin的表達(dá)均較正常組明顯增加(P<0.01),E-cadherin則較正常組顯著降低(P<0.01)。而經(jīng)PA、PW和PP干預(yù)之后,NRK-52E細(xì)胞中的α-SMA和desmin較模型組明顯降低(P<0.01或 P<0.05),E-cadherin 表達(dá)增加(P<0.01 或 P<0.05),其中PP的干預(yù)效果最佳。綜上,PA、PW和PP均可抑制NRK-52E細(xì)胞的EMT作用。見圖1-3。

      3 討論

      圖1 桑黃不同提取物對α-SMA表達(dá)的影響(與對照組比較,??P<0.01;與TGF-β1模型組比較,#P<0.05,##P<0.01)

      圖2 桑黃不同提取物對demin表達(dá)的影響(與對照組比較,??P<0.01;與TGF-β1模型組比較,#P<0.05,##P<0.01)

      圖3 桑黃不同提取物對E-cadherin表達(dá)的影響(與對照組比較,??P<0.01;與TGF-β1模型組比較,#P<0.05,##P<0.01)

      桑黃,又稱桑臣、桑耳、桑黃菇等,是寄生于桑樹等闊葉樹的一種藥用真菌。桑黃的主要成分包括多糖、甾體、黃酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)、萜類、香豆素類物質(zhì)及生物堿[4]。桑黃具有廣泛的藥理活性,包括抗氧化[5]、抗血管生成[6]、降血糖[7]、自由基清除[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]和抗腫瘤作用[10]。桑黃是活血化瘀藥,其子實(shí)體入藥,味微苦,性寒,具有活血、化飲、補(bǔ)虛、清熱解毒之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明多糖、黃酮和萜類是其主要活性成分。桑黃是一種珍貴的藥用真菌,已吸引國內(nèi)外越來越廣泛的關(guān)注。研究證實(shí)桑黃具有抗腫瘤、抗肝纖維化和抗氧化等作用。桑黃的抗肝纖維化作用在動物實(shí)驗中已得到證實(shí)。然而,桑黃是否具有抗腎纖維化作用尚未見報道。

      在本研究中,首先評估了不同濃度PA、PW和PP對NRK-52E細(xì)胞增殖的影響。在此基礎(chǔ)上,作者分別選取了100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP三個對細(xì)胞無毒副作用的濃度用于后續(xù)的EMT干預(yù)實(shí)驗。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1組中E-cadherin較正常組明顯降低,而α-SMA和desmin較正常組明顯增加。而經(jīng)PA、PW和PP干預(yù)之后,NRK-52E細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)較TGF-β1組明顯上調(diào),α-SMA和desmin則明顯降低,其中以PP的效果最為明顯,推測PP可能是桑黃中抑制NRK-52E發(fā)生EMT最有效的成分。

      綜上所述,桑黃不同提取物可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。EMT是一個錯綜復(fù)雜的過程,阻斷其中任何一個環(huán)節(jié)均有可能抑制其進(jìn)程。本文僅檢測了EMT發(fā)生的下游效應(yīng)因子,其具體機(jī)理尚不明確,還有待于進(jìn)一步的探究。

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