豬胸膜肺炎放線桿菌ftsI基因的克隆及分析

郝知友，鄒玖零，禹小芳，屈蓓蓓，李英明，黃復(fù)深

（1.湖南省永州市畜牧水產(chǎn)局，永州 425000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙 410000）

0 引言

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由豬胸膜肺炎放線桿菌感染引起的一種高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。主要表現(xiàn)為急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎，該病發(fā)病快，常引起大批豬只死亡[1]。該病的防治主要采用抗生素和滅活苗進(jìn)行，但由于豬胸膜肺炎放線桿菌血清型多，各地流行存在差異，滅活苗交叉保護(hù)效果離臨床要求較遠(yuǎn)，因此多采用抗生素進(jìn)行治療?？股氐氖褂每赡墚a(chǎn)生耐藥性，因此需尋找新的藥物靶點(diǎn)，篩選新的藥物[2-3]。研究細(xì)菌細(xì)胞分裂是篩選藥物新靶點(diǎn)的途徑之一[4-5]。

FtsI是在細(xì)菌分裂過程中一個(gè)重要的蛋白分子[6]，F(xiàn)tsI是原核細(xì)胞分裂時(shí)的主要細(xì)胞骨架蛋白，與微管蛋白同源，細(xì)胞分裂時(shí)可與其他的細(xì)胞分裂蛋白組裝成Z環(huán)，Z環(huán)的收縮促進(jìn)細(xì)胞分裂。研究表明[7-10]：關(guān)于ftsI的報(bào)道主要見于植物葉綠體和人患疾病的研究，但是專門針對(duì)APP的FtsI基因及相應(yīng)的編碼蛋白卻未見研究報(bào)道。目前研究最多的是FtsI，它廣泛存在于原核生物、真核生物，而且不同物種中ftsI基因在序列和結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)高度的保守性[4，11-14]。細(xì)菌細(xì)胞分裂與FtsI蛋白水平密切相關(guān)，純化的ftsI蛋白是一種具有GTP酶活性的GTP結(jié)合蛋白[15]，而且GTP酶活性和ftsI蛋白的濃度密切相關(guān)。研究表明至少含有21個(gè)與App細(xì)胞分裂體相關(guān)蛋白質(zhì)的基因參與了App的細(xì)胞分裂過程，其中ftsL參與分裂體成熟和穩(wěn)定的肽聚糖（PG）結(jié)合蛋白基因[14]。本研究的目的是通過對(duì)App ftsI基因的分析，了解其在豬胸膜肺炎放線桿菌細(xì)胞分裂的意義，為下一步研究藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基

豬胸膜肺炎放線桿菌血清型Ⅰ于本實(shí)驗(yàn)室保存，胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司，無支原體超級(jí)新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，NAD氧化型輔酶Ⅰ購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

PCR反應(yīng)用試劑（2×Taq PCR Master Mix）、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量（D2 000 Maker）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.3 FtsI基因的擴(kuò)增與鑒定

常規(guī)方法提取細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)GenBank中已收錄的App基因組序列收錄的FtsI基因序列，采用軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)FtsI外引物一對(duì)。PF：5’-AAATCAGCACGAGGGAGATAAAA-3’，PR：5’-GTTTGCCCC TTATTCCTATCTTA-3'。FtsI基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定后送上海生物工程公司測(cè)序。

1.4 ftsI序列

測(cè)序結(jié)果采用開放式閱讀框ORF在線分析軟件分析，跨膜區(qū)采用應(yīng)用TMHMM軟件和SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）軟件分析，將其相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析。應(yīng)用在線blast軟件找出豬胸膜肺炎放線桿菌不同血清型的ftsI蛋白的相關(guān)序列，用臨接法（NJ）繪制出基因進(jìn)化樹進(jìn)行分析，同時(shí)采用Megalign軟件對(duì)不同血清型的所有蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果

2.1 APP的ftsI目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以豬胸膜肺炎放線桿菌血清型1的基因組為模板，對(duì)目的基因ftsI進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見一條2 000 bps左右的特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶，與目的基因基本一致，ftsI基因PCR擴(kuò)增電泳圖見圖1。核苷酸序列在GenBank登錄，登錄序列號(hào)：KT253252。經(jīng)ORF分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長(zhǎng)1 752 bp，含1個(gè)完整開放的閱讀框（ORF），由起始密碼子ATG至終止密子TAA，編碼584個(gè)氨基酸，編碼蛋白的理論分子量為42.6 kD，等電點(diǎn)為4.72。

2.2 ftsI基因序列

ftsI基因序列與GenBank中已報(bào)道的APP的血清1、3、5、7、8型相似度為96%～100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，App的ftsI基因?qū)儆谶M(jìn)化的一個(gè)分支，與副嗜血桿菌有相近的親緣關(guān)系，而與大腸桿菌等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，ftsI的系統(tǒng)發(fā)育見圖 2。

圖1 ftsI基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 ftsI的系統(tǒng)發(fā)育

2.3 ftsI蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

應(yīng)用SOPMA軟件和TMHMM軟件分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tsI蛋白跨膜蛋白具1個(gè)跨膜區(qū)，跨膜區(qū)分析見圖3。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)具有α-螺旋區(qū)、β-折疊區(qū)、β-轉(zhuǎn)角區(qū)和無規(guī)卷曲4個(gè)結(jié)構(gòu)類型，其中α-螺旋區(qū)占二級(jí)結(jié)構(gòu)的66.90%，β-折疊占二級(jí)結(jié)構(gòu)的60.00%，轉(zhuǎn)角占15.40%。分析三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其具有2個(gè)模塊（Motif），App FtsI的三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖4。

圖3 跨膜區(qū)分析

3 討論與結(jié)論

研究表明豬胸膜肺炎放線桿菌呈短桿狀或球桿狀，菌體長(zhǎng)短不一，菌體表層面有絨毛，其一端有一明顯的凹陷；細(xì)胞的分裂可發(fā)生在細(xì)胞中部或細(xì)胞的一極。至少含有21個(gè)與App細(xì)胞分裂體相關(guān)蛋白質(zhì)的基因參與了App的細(xì)胞分裂過程，其中ftsL參與分裂體成熟和穩(wěn)定的肽聚糖（PG）結(jié)合蛋白基因的過程[14]。

圖4 App FtsI的三級(jí)結(jié)構(gòu)

研究從App基因組中擴(kuò)增了App的FtsI 基因。研究表明該基因全長(zhǎng)1 746 bp，含一個(gè)開放閱讀框（ORF），由起始密碼子ATG至終止密子TAA，編碼582個(gè)氨基酸。編碼蛋白的理論分子量為42.6 kD，等電點(diǎn)為4.72。與APP的血清1、3、4、5型相似度為96%～100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，App的ftsI基因?qū)儆谶M(jìn)化的一個(gè)分支，與副嗜血桿菌有相近的親緣關(guān)系，而與大腸桿菌等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)，ftsI蛋白在APP各血清型的同源性甚高，該蛋白可能成為App的廣普藥靶，且在其他病原菌也有一定的作用。

細(xì)菌細(xì)胞分裂涉及一類對(duì)熱敏感的基因，當(dāng)外界環(huán)境的溫度升高時(shí)，這些基因的突變體表現(xiàn)出分裂活動(dòng)的停滯，形成不分裂的長(zhǎng)絲狀菌體，但在正常的生長(zhǎng)溫度條件下，則進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂活動(dòng)，這些對(duì)熱敏感的細(xì)胞分裂突變體統(tǒng)稱為fts突變體[8]。研究表明fts突變體涉及多個(gè)基因的參與，包括ftsL、ftsI、ftsW、ftsQ、ftsA、ftsZ、ftsJ、ftsH、ftsK、ftsB、ftsX、ftsY等，這些基因編碼的蛋白質(zhì)參與細(xì)菌細(xì)胞分裂中的多個(gè)過程[4]。

研究以App血清1型基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出ftsL的目的基因片斷。FtsI廣泛存在于細(xì)菌中，是細(xì)胞分裂的一種重要功能蛋白。細(xì)菌細(xì)胞分裂時(shí)，單體FtsI蛋白聚集在一起組裝合成肌纖維，于分裂位點(diǎn)處形成Z-ring（Z環(huán)），與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面鑲嵌。Z環(huán)所在平面為分裂母細(xì)胞分裂部位[16]。FtsI的N端具有ATPase結(jié)構(gòu)域，水解GTP，為質(zhì)膜收縮供給動(dòng)力，并順利分裂細(xì)胞[10]，F(xiàn)tsI與其他細(xì)胞分裂相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的共同作用，參與DNA的分離和細(xì)胞生長(zhǎng)等重要生理過程[10，13]。同時(shí)，F(xiàn)tsI參與細(xì)菌細(xì)胞分裂時(shí)染色體的凝集[17]以及細(xì)胞壁的形成[16]。綠膿假單胞菌的研究表明，該基因的表達(dá)與細(xì)菌的耐藥性相關(guān)[18]，該研究為進(jìn)一步研究App的 FtsI的功能及其在藥物篩選的意義奠定了基礎(chǔ)。