翟曉鑫 高花 姜平 許崇波 張宗輝 李文哲 高鳳山

（1. 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622；2. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大連 116044；3. 韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院 粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，韶關(guān) 512005）

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）是一類編碼與免疫應(yīng)答直接相關(guān)的基因群，在絕大部分脊椎動物中都有表達(dá)［1-2］，MHC表達(dá)產(chǎn)物在抗原遞呈和T細(xì)胞激活中起到關(guān)鍵作用［3］。不同動物MHC有不同的命名，豬的MHC也叫做豬白細(xì)胞抗原（Swin eleukuocyte antigen，SLA）［4］。SLA分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個基因類型，其中SLA Ⅰ類分子表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面，屬于高度多態(tài)的糖蛋白，該類分子能夠在細(xì)胞中特異性識別經(jīng)蛋白酶體處理后的內(nèi)源性抗原并可將其遞呈到細(xì)胞膜表面，進(jìn)而和CD8+T淋巴細(xì)胞表面的TCR受體特異性結(jié)合，激活CD8+T淋巴細(xì)胞并啟動細(xì)胞免疫［5］。SLA Ⅰ類分子由重鏈和輕鏈組成，SLA Ⅰ重鏈基因包含3類基因即Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc，共13個基因座。其中只有Ia包含3個功能基因，分別是SLA-1、SLA-2、SLA-3。SLA-2在信號肽起始端較SLA-1、SLA-3多3個氨基酸殘基［4］。

近年來，針對多個品系豬的SLA-2基因進(jìn)行了原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達(dá)，以及多肽結(jié)合等功能研究［6-12］。然而，原核表達(dá)的SLA-2多為包涵體形式，需要經(jīng)過變性和復(fù)性等繁瑣的過程才能使SLA-2形成正確的折疊［13］。由于原核細(xì)胞不具有高爾基體，所以不能進(jìn)行糖基化等功能修飾。因此，相對于真核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)原核細(xì)胞表達(dá)的SLA-2其空間折疊及功能必然不如真核表達(dá)系統(tǒng)的效果。目前基于真核表達(dá)水平上對人HLA-A2基因，以及小鼠H-2基因的相關(guān)研究已經(jīng)趨于成熟［14-16］，但是針對豬SLA-2基因真核表達(dá)的研究鮮有報導(dǎo)。

PK15細(xì)胞（Porcine kidney epithelial cells）來源于豬腎，中文名為豬腎上皮細(xì)胞，屬于真核表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞。該細(xì)胞也廣泛應(yīng)用于豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬細(xì)小病毒等的分離、體外培養(yǎng)以及相關(guān)疫苗的生產(chǎn)［17］。將不同SLA-2基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞中，能夠保證SLA-2分子形成正確的折疊，從而行使正確的功能。因此可以在PK15細(xì)胞系上研究任何SLA-2基因的表達(dá)、抗原遞呈以及能夠更高效地進(jìn)行抗原表位的篩選等。

實驗室前期已經(jīng)成功克隆了荷包豬SLA-2-HB01全基因［18］，本實驗在此基礎(chǔ)上擬將荷包豬SLA-2-HB01編碼區(qū)基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pEGFP N3上，并轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞，驗證SLA-2分子在該細(xì)胞中的表達(dá)，為后期篩選豬烈性傳染病病毒相應(yīng)的抗原表位肽奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和菌株 豬腎細(xì)胞（PK15）購自中國獸醫(yī)監(jiān)測所微生物菌種保藏管理中心（CVCC）。

荷包豬SLA-2-pMD 18-T全基因（GenBank編號：AB602431.1）質(zhì)粒由大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院基因和蛋白質(zhì)工程實驗室保存。pMD 19-T Simple Vector，Escherichia coli.Top10、Escherichia coli.DH5α菌種購自大連寶生物有限公司。pMD 19-T Simple Vector用于SLA-2-HB01基因的高效克隆。Escherichia coli.Top10感受態(tài)細(xì)胞用于擴(kuò)增含有目的基因的重組質(zhì)粒，以便進(jìn)一步進(jìn)行目的基因的克隆改造。pEGFP N3菌種購自于中國上海思享生物有限責(zé)任公司。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、 氯 化 鈉（NaCl）、Tris、 瓊 脂 糖、牛血清白蛋白Ⅴ（Albu min Bovine Ⅴ）、麗春紅、SanPrep柱式吸附柱小量質(zhì)粒提取試劑盒、SanPrep柱式吸附柱DNA膠回收試劑盒、小鼠抗eGFP單克隆抗體（貨號：D199989-0100）、小鼠抗GAPDH單克隆抗體（貨號：D190636-0100）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（貨號：D110087-0100）以及離心管、槍頭等實驗耗材均購自上海生工生物工程有限公司；寡核苷酸的合成和DNA測序由上海生工生物有限公司完成。Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase、1 kb DNA Ladder、核酸染料Ultra Gelred Nucleic Acid Stain（10000×）、Lipoectine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自諾唯贊有限公司。T4 DNA Ligase、DL 2000 DNA Marker、EcoR I限制性快速內(nèi)切酶、KpnI限制性快速內(nèi)切酶、10×上樣緩沖液（loading buffer）均購自寶生物工程（大連）有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶消化液購自Gibco公司；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司，6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板購自NEST公司。其他常見的分子生物學(xué)試劑以及化學(xué)試劑都來自天津化學(xué)試劑有限公司和北京化學(xué)試劑有限公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自新賽美生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)引物設(shè)計原則，參考GenBank（AB602431.1）上豬SLA-2-HB01全基因序列，采用Vector NTI 11.2和Primer6.0軟件相結(jié)合設(shè)計引物，根據(jù)載體pEGFP N3的結(jié)構(gòu)特點，選擇的限制性內(nèi)切酶為：EcoR I和KpnI。上游引物F：5′-GAATTCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCA -3′（下劃線為EcoR I酶切位點）；下游引物R：5′-GGT ACCCACTCTAGGATCCTTGGTAAGG-3′（ 下 劃 線 為KpnI酶切位點）。由上海生工生物工程有限公司定制合成。

1.2.2 荷包豬SLA-2-HB01/ pMD 19-T Simple克隆以SLA-2-HB01/pMD 18-T質(zhì)粒為模板，用Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR體 系 為 ：5×SF buffer（with 10 mmol/L MgSO4），10 μL ；dNTP Mix（10 mmol/L each），1 μL ；DMSO，1.5 μL ；SLA-2-HB01-F（10 μmol/L），2 μL ；SLA-2-HB01-R（10 μmol/L），2 μL ；SLA-2-HB01 全基因質(zhì)粒，2 μL ；Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL），1 μL ；H2O，32.5 μL。

PCR條件為：92℃，預(yù)變性2 min；92℃，10 s；58℃，30 s；72℃，30 s，30個循環(huán)；最后72℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，凝膠成像儀成像。目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

將膠回收的目的條帶與pMD 19 -T simple載體連接，轉(zhuǎn)化Escherichia coli. Top10，篩選陽性克隆菌并送至生物公司測序，通過雙向DNA測序確認(rèn)插入完整性后，將測序正確的陽性克隆菌株命名為SLA-2-HB01/pMD 19-T Simple。

1.2.3 荷包豬SLA-2-HB01真核表達(dá)載體的構(gòu)建 分別對SLA-2-HB01/pMD19-T Simple以及真核表達(dá)載體pEGFP N3質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和KpnI雙酶切，然后經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并經(jīng)DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將兩者回收產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化至Escherichia coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Kan+的LB平板中，37℃培養(yǎng)過夜。然后挑取單菌落至Kan+LB液體培養(yǎng)基中，37℃，12 h振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)的菌液利用限制性雙酶切分析鑒定真核重組DNA載體中是否攜帶插入片段。最后，通過對DNA測序結(jié)果進(jìn)行序列分析驗證核苷酸序列的正確性。陽性重組質(zhì)粒命名為 SLA-2-HB01/pEGFP N3，重組質(zhì)粒SLA-2-HB01/pEGFP N3圖譜，見圖1。

圖1 SLA-2-HB01/pEGFP N3重組表達(dá)質(zhì)粒示意圖

1.2.4 PK15細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)PK15細(xì)胞，并將PK15細(xì)胞傳代兩次以上，加入1.5 mL 0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞并計數(shù)，在6孔板中每孔接種3×105個細(xì)胞，24 h之后細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，用Lipoectine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SLA-2-HB01/pEGFP-N3真核重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染30 min前，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成1.5 mL Opti-MEM I培養(yǎng)基，分別用250 μL Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋2 μg重組真核表達(dá)質(zhì)粒和2 μL Lipoectine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置5 min。混合Lipoectine2000和質(zhì)粒的稀釋液共500 μL，輕輕混勻，室溫靜置20 min。向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的每個孔中加入預(yù)混液500 μL，并前后輕輕搖動6孔細(xì)胞培養(yǎng)板使預(yù)混液與孔中的培養(yǎng)基混勻。細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6 h后，將含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基去除，加入1.5 mL新鮮的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，用500 μg/mL G418抗性篩選。

1.2.5 單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞系培養(yǎng) 用含500 μg/ mL G418抗性培養(yǎng)基持續(xù)篩選已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系15 d后，加入2 mL 1×PBS清洗細(xì)胞，重復(fù)一次，加入1.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化液消化15 min，收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度稀釋至7-8 cells/mL，共10 mL，接種至96孔板，每孔加入100 μL培養(yǎng)基。細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)3 d后，標(biāo)記出96孔板中生長的單細(xì)胞，細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)8 d后，標(biāo)記的單克隆細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)，100 μL 1×PBS清洗單克隆細(xì)胞，加入30 μL 0.25%胰蛋白酶消化液原孔消化10 min，并加入70 μL含10%血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d左右，待細(xì)胞基本鋪滿孔板時用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞15 min，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入6孔板中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。3-4 d的細(xì)胞將鋪滿整個6孔板，轉(zhuǎn)入100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后一半細(xì)胞用于凍存，一半細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞系鑒定 待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，分別取正常PK15細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pEGFP N3空載質(zhì)粒的PK15細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒PK15細(xì)胞，分別提取細(xì)胞全蛋白進(jìn)行鑒定，具體操作如下：收集各種細(xì)胞于滅菌EP管中，利用1×PBS洗兩遍后，根據(jù)細(xì)胞量加入100-500 μL裂解液，用槍吹打5-8次后，放在冰上并用搖床搖晃15 min，中間彈動2次，使細(xì)胞充分裂解。裂解完畢后，利用4℃離心機，12 000 r/min，離心10 min，使細(xì)胞碎片全部沉到離心管底部。將上清吸入到新的離心管中，利用BCA法［19］檢測蛋白濃度后，將蛋白制成終濃度為10 μg/μL的溶液，取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

蛋白樣品進(jìn)一步轉(zhuǎn)印到PVDF膜后，經(jīng)1×麗春紅染色后參考marker切割目的條帶和內(nèi)參GAPDH，5% BSA室溫封閉1 h，含目的條帶的膜加入1∶5 000稀釋的小鼠抗eGFP單克隆抗體，含GAPDH條帶的膜加入1∶8 000稀釋的小鼠抗GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜，去除一抗，經(jīng)1×TBST洗滌4次后加入1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫?fù)u床上孵育1 h，1×TBST洗滌4次，采用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色，以檢測EGFP及EGFP融合基因的表達(dá)。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析Western雜交條帶累積光密度值（IOD），并計算出目的蛋白相對光密度值（SLA-2-HB01-EGFP的IOD值與GAPDH的IOD值之比）然后采用GraphPad Prism 5分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 荷包豬SLA-2-HB01/pMD 19-T Simple克隆

PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像儀成像，結(jié)果（圖2-A）顯示目的條帶大小約為1 100 bp，與理論值1 104 bp相符。經(jīng)單菌落PCR后，瓊脂糖電泳檢測到擴(kuò)增條帶大小約1 100 bp（圖2-B），與理論設(shè)計值1 104 bp相符。

圖2 荷包豬SLA-2-HB01/pMD 19-T Simple克隆

2.2 荷包豬SLA-2-HB01真核表達(dá)載體鑒定

2.2.1 限制性雙酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒SLA-2-HB-01/pEGFP N3 利用EcoR I和KpnI對重組表達(dá)質(zhì)粒SLA-2-HB01/pEGFP N3進(jìn)行雙酶切鑒定，0.8%瓊脂糖電泳檢測，顯示插入片段大約1 000 bp，與理論設(shè)計值1 092 bp相符（去掉部分酶切位點），見圖3。

圖3 限制性雙酶切鑒定SLA-2-HB01/pEGFP N3重組真核表達(dá)質(zhì)粒

2.2.2 序列分析 SLA-2-HB01/pEGFP N3 經(jīng)核酸序列測定后，通過NCBI網(wǎng)站進(jìn)行了Blast，結(jié)果（圖4）顯示，SLA-2-HB01/pEGFP N3重組真核表達(dá)質(zhì)粒中SLA-2-HB01基因序列與原序列100%同源。

2.3 熒光倒置顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒的PK15細(xì)胞

SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞48 h后，通過熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果經(jīng)Image-Pro Plus軟件分析顯示（圖5），大約40%的PK15細(xì)胞出現(xiàn)了綠色熒光，主要分布在細(xì)胞漿區(qū)域。

2.4 熒光鑒定單克隆細(xì)胞系

經(jīng)G418篩選出的陽性單細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)接種于6孔板中，熒光顯微鏡觀察接種后第1、2、4天PK-15細(xì)胞熒光，結(jié)果（圖6）顯示陽性單克隆細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后表達(dá)有EGFP的PK-15細(xì)胞占到99%以上。

2.5 Western Blotting檢測轉(zhuǎn)染SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒的PK15細(xì)胞中SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白的表達(dá)情況

分別提取正常PK15細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pEGFP N3空載質(zhì)粒的PK15細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒PK15細(xì)胞總蛋白，以正常PK15細(xì)胞總蛋白作為空白對照，以轉(zhuǎn)染pEGFP N3空載質(zhì)粒的PK15細(xì)胞總蛋白作為陰性對照，通過Western blotting檢測融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果（圖7）顯示轉(zhuǎn)染SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒PK15細(xì)胞中融合蛋白得到了高表達(dá)，分子量大小為70 kD。

3 討論

近年來，豬源烈性傳染病廣泛存在，而且很難對其進(jìn)行防治，原因是烈性傳染病一般禁止用免疫效果較好但存在二次感染危險的活毒疫苗，而允許使用的滅活疫苗雖然能起到一定的免疫保護(hù)作用，但不能徹底消滅病毒感染［20］。以CTL多肽表位為基礎(chǔ)的表位疫苗有助于對豬烈性傳染病的預(yù)防及控制，目前大量實驗室也開展了相關(guān)研［21-22］。在眾多CTL多肽表位中，相較于MHC分子體外結(jié)合篩選以及MHC四聚體篩選的多肽而言，細(xì)胞自然遞呈的多肽無疑是最理想的。

本實驗將編碼荷包豬MHCⅠ類分子重鏈的基因SLA-2-HB01編碼區(qū)構(gòu)建到了真核表達(dá)載體pEGFP N3上，并借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑成功地轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞中，使荷包豬的MHCⅠ類分子能夠在PK15細(xì)胞中過表達(dá)，目的是建立外源SLA-2-HB01在PK15細(xì)胞上的抗原遞呈研究體系，并為后續(xù)的抗原遞呈及多肽表位篩選提供研究平臺。

本次實驗選擇荷包豬SLA-2-HB01基因為研究對象，基于荷包豬品種特殊，具有耐粗飼、抗病能力強、肉質(zhì)鮮美等特點，并且具有很好的科學(xué)研究價值［23］。前期研究發(fā)現(xiàn)荷包豬的SLAⅠ類基因進(jìn)化較為原始，SLA-2-HB01重鏈基因編碼區(qū)共1 095個堿基，編碼364個氨基酸，相較于SLA-1-HB01以及SLA-3-HB01，SLA-2-HB01重鏈基因信號肽起始位置多3個氨基酸，鑒于基因的特殊性，課題組首先選取了SLA-2-HB01進(jìn)行研究。

本次實驗的一個關(guān)鍵之處在于能否成功構(gòu)建SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒，在構(gòu)建的重組SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒中，SLA-2-HB01與EGFP基因共用一個CMV啟動子，最終表達(dá)為融合蛋白（EGFP在SLA-2-HB01分子重鏈的羧基端）。因此，在進(jìn)行引物設(shè)計時需要將SLA-2-HB01中的終止密碼子“UGA”去除以保證翻譯到該位點時不發(fā)生終止，繼續(xù)向下游的EGFP進(jìn)行翻譯。在測序結(jié)果中我們能夠看到位于SLA-2-HB01編碼區(qū)3′末端的“TGA”已經(jīng)成功去除（圖4），同時也沒有發(fā)生移碼突變，保證了SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白能夠正確翻譯。EGFP是能夠增強熒光特性的綠色熒光蛋白，其空間結(jié)構(gòu)較為緊密，呈桶狀［24］。該結(jié)構(gòu)特征一方面有助于保護(hù)EGFP的整體構(gòu)象，使其熒光特性不受連接的其他大分子的影響，另一方面EGFP如此緊密的空間結(jié)構(gòu)也保證了不影響與其連接的大分子（本實驗中的SLA-2-HB01分子）的正確折疊以及在PK15細(xì)胞中的正常轉(zhuǎn)運等［25］。

圖4 Blast分析SLA-2-HB01/pEGFP N3序列

圖5 熒光倒置顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染SLA-2-HB01/pEGFP N3質(zhì)粒的PK15細(xì)胞（×200）

圖6 熒光鑒定陽性單克隆細(xì)胞系

圖7 Western Blotting檢測SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白在PK15細(xì)胞中的表達(dá)情況

本次實驗的另一個關(guān)鍵之處是能否檢測到PK15細(xì)胞中外源的SLA-2-HB01分子重鏈的表達(dá)情況，實驗選用的真核表達(dá)載體pEGFP N3自帶編碼綠色熒光蛋白的基因，通過熒光倒置顯微鏡可以初步觀察到PK15細(xì)胞中表達(dá)了綠色熒光蛋白（圖5），跟蹤檢測陽性單克隆細(xì)胞在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)綠色熒光較篩選前覆蓋率得到提升，達(dá)到99%（圖6-F），并且主要分布在細(xì)胞漿中（圖6-G），這與經(jīng)典的MHC相關(guān)理論是相符的。我們進(jìn)一步通過Western Blotting檢測了PK15細(xì)胞中SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白的表達(dá)情況，陰性對照組中EGFP蛋白條帶位于30 kD附近（EGFP分子量為30 kD），而轉(zhuǎn)染組中EGFP條帶位于70 kD附近，又因為SLA-2-HB01分子量為40 kD，因此能夠判斷在轉(zhuǎn)染組中EGFP融合著SLA-2-HB01分子表達(dá)。另外相較于空白組，轉(zhuǎn)染組中目的基因有很強的陽性表達(dá)（P＜0.01），進(jìn)一步驗證了SLA-2-HB01基因在PK15細(xì)胞中得到表達(dá)。

4 結(jié)論

本實驗成功構(gòu)建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重組質(zhì)粒，并在PK15細(xì)胞中表達(dá)，為研究外源性SLA-2-HB01在PK15細(xì)胞中的抗原遞呈規(guī)律及表位篩選奠定基礎(chǔ)。