胡煒張吉?jiǎng)Ⅵ巫T春明孫通

1.青島出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東青島 266001；2.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局；3.中國海洋大學(xué)

我國是全球稻米的種植大國，2014年我國稻米產(chǎn)量2.06億噸，占全世界的41.7%，稻米資源豐富。大米蛋白不僅具有合理的氨基酸配比、低致敏性、與動(dòng)物蛋白相媲美的生物價(jià)與蛋白質(zhì)效用比等營養(yǎng)價(jià)值，還有抗癌變等保健功能。大米蛋白的深度開發(fā)與利用日益受到重視[1-5]。

具有激素調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗氧化等功能的生物活性肽是大米蛋白深加工的重要產(chǎn)品，抗氧化肽作為其中一種，具有很強(qiáng)的功能性與很高的安全性。酶解法生產(chǎn)條件溫和，水解比較容易控制，可以生產(chǎn)特定的產(chǎn)品，且成本相對(duì)低廉，是目前生產(chǎn)活性肽的首選[6]。通過酶解法制備大米蛋白抗氧化肽可以很好地延伸大米加工產(chǎn)業(yè)鏈。

在本文的前期研究中，以大米蛋白粉為反應(yīng)底物，選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種蛋白酶為工具酶，以酶解液對(duì)DPPH自由基的清除率及水解度為指標(biāo)，選取酶解pH、酶解溫度、加酶量、底物濃度分別做單因素實(shí)驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定最佳用酶，而后采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化得到了最佳酶解工藝。

蛋白質(zhì)酶解后會(huì)產(chǎn)生一些含有疏水性氨基酸殘基的肽類，從而導(dǎo)致不同苦味的產(chǎn)生。為了獲得營養(yǎng)與口感風(fēng)味俱佳的肽類產(chǎn)品，人們目前常運(yùn)用選擇性分離、包埋掩蓋法、酶法、微生物發(fā)酵法等技術(shù)降低肽類的苦味。相比于選擇性分離、酶法等技術(shù)，包埋掩蓋法既不會(huì)影響肽類的功能性，還可以通過包埋劑將苦味氨基酸進(jìn)行包埋達(dá)到脫苦的功效，常用的包埋劑有谷氨酸鈉、明膠、甘氨酸、環(huán)狀糊精等。β-環(huán)狀糊精是一種具有像酶一樣的疏水結(jié)合部分的低聚糖，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且其無毒、低成本的特性促使他成為一種優(yōu)良的包埋劑。

本文使用β-環(huán)狀糊精對(duì)大米蛋白抗氧化肽進(jìn)行脫苦實(shí)驗(yàn)，根據(jù)β-環(huán)狀糊精添加量、溫度、pH 和時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，通過脫苦效果得分（百分制），確定β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽的最佳工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 材料

大米蛋白（食品級(jí)）：湖南潤濤生物科技股份有限公司（含蛋白質(zhì)≥80%，纖維素≤6%，碳水化合物≤10%，脂肪≤2%，灰分≤2%）；

木瓜蛋白酶：南寧東恒華道生物科技公司；

β-環(huán)狀糊精：孟州市華興生物化工責(zé)任有限公司。

1.2 設(shè)備

水浴鍋；噴霧干燥器；離心機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大米蛋白抗氧化肽的制備

稱取一定量大米蛋白，與一定量蒸餾水配置成底物質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的蛋白液，調(diào)節(jié)pH值為5.25，按加酶量5.6 U/mL加入木瓜蛋白酶，置于恒溫水浴鍋中61.4℃溫度下酶解1 h，結(jié)束后于沸水浴中滅酶10 min，然后在3 500 r/min下離心10 min，取上清液進(jìn)行噴霧干燥，得肽粉。

2.2 苦味的評(píng)價(jià)方法

感官評(píng)價(jià)和儀器評(píng)價(jià)是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物苦味的兩種主要方法。但這兩種方法均有不足，感官評(píng)價(jià)雖然簡(jiǎn)單但是容易因主觀因素而產(chǎn)生較大的差異；儀器評(píng)價(jià)法是未來的發(fā)展趨勢(shì)，但卻受到技術(shù)限制，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味強(qiáng)弱亟需新型的方法來評(píng)價(jià)。目前仍然是以感官分析方法作為主要的苦味評(píng)價(jià)方法，儀器分析作為輔助評(píng)價(jià)方法。在此選用感官評(píng)價(jià)分析方法對(duì)苦味進(jìn)行評(píng)定。

2.3 苦味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的確定

人為地將大米蛋白抗氧化肽的濃度分為10個(gè)等級(jí)，分別對(duì)應(yīng)10個(gè)分值，將大米蛋白抗氧化肽濃度為10.0%的苦味值規(guī)定為10，依此類推，共10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)苦味值，詳見表1。取待評(píng)液2～3 mL放入口中充分品嘗，之后與標(biāo)準(zhǔn)苦味值溶液進(jìn)行對(duì)比，反復(fù)嘗試直到確定其苦味值為止。最后的苦味值取自5人以上的平均值。

表1 苦味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.4 β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽的單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 β-環(huán)狀糊精添加量對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

取5只50 mL燒杯，每只燒杯中放入準(zhǔn)確稱取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g，分別加入9.0 mL蒸餾水，pH調(diào)節(jié)為6.0，分別加入β-環(huán)狀糊精0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g，然后放在40℃的水浴鍋當(dāng)中恒溫反應(yīng)60 min，按照表1苦味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究β-環(huán)狀糊精添加量對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響。

2.4.2 溫度對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

取5只50 mL燒杯，每只燒杯中放入準(zhǔn)確稱取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g和最適β-環(huán)狀糊精添加量0.3 g，分別加入9.0 mL蒸餾水，pH調(diào)節(jié)為6.0，在溫度分別為 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的水浴鍋中恒溫反應(yīng)60 min，按照表1苦味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究溫度對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響。

2.4.3 pH對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

取5只50 mL燒杯，每只燒杯中放入準(zhǔn)確稱取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g和β-環(huán)狀糊精0.3 g，分別加入9.0 mL蒸餾水，pH分別調(diào)節(jié)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后在40℃的水浴鍋中恒溫反應(yīng)60 min，按照表1苦味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究pH對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響。

2.4.4 時(shí)間對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

取5只50 mL燒杯，每只燒杯中放入準(zhǔn)確稱取的大米蛋白抗氧化肽1.0 g和β-環(huán)狀糊精0.3 g，分別加入9.0 mL蒸餾水，pH調(diào)節(jié)為6.0，然后在40℃的水浴鍋中分別恒溫反應(yīng)10 min、30 min、60 min、90 min、120 min，按照表1苦味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究時(shí)間對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響。

2.4.5 β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽的最優(yōu)條件確定

在大米蛋白抗氧化肽脫苦的單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以β-環(huán)狀糊精添加量、溫度、pH和時(shí)間為四因素，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表，通過脫苦效果得分（百分制），確定β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽的最佳工藝。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 β-環(huán)狀糊精添加量對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

由圖1可知，在β-環(huán)狀糊精添加量為0.1～0.3 g的范圍內(nèi)，大米蛋白抗氧化肽的苦味值隨著β-環(huán)狀糊精的加入量增加而開始降低，當(dāng)加入量為0.3 g時(shí)苦味值出現(xiàn)最低；而繼續(xù)增加時(shí)苦味值反而上升。分析β-環(huán)狀糊精加入一定量后會(huì)產(chǎn)生焦糊味，另外，焦糊味隨加入量的增加而加重。因此選取0．25～0．35 g作為β-環(huán)狀糊精較適宜的添加量范圍開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 β-環(huán)狀糊精添加量對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

3.1.2 溫度對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

由圖2可知，剛開始隨著溫度的上升大米蛋白抗氧化肽的苦味值逐漸降低，當(dāng)溫度為40℃時(shí)苦味值降為最低，40℃之后隨著溫度的升高苦味值反而上升。這可能跟β-環(huán)狀糊精吸收的能量有關(guān)，β-環(huán)狀糊精加入量過多時(shí)吸收能量也會(huì)過多，從而導(dǎo)致其分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而使其包埋能力降低。因此選取30～50℃作為β-環(huán)狀糊精較適宜的反應(yīng)溫度范圍開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 溫度對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

3.1.3 pH值對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

由圖3可知，大米蛋白抗氧化肽的苦味值在pH 4到6范圍內(nèi)，隨著pH的升高而降低，并在pH為6．0時(shí)苦味呈現(xiàn)最低值，但是，當(dāng)pH＞6．0時(shí)，苦味值反而回升，且具有隨著pH的升高而上升的趨勢(shì)。這可能是β-環(huán)狀糊精的微結(jié)構(gòu)受pH值影響，分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低了脫苦的效率和選擇性，從而影響其包埋能力。 因此選取 pH 值 5．5～6．5作為 β-環(huán)狀糊精較適宜的反應(yīng)pH范圍開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 pH值對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

3.1.4 時(shí)間對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

由圖4可知，大米蛋白抗氧化肽的苦味值并沒有隨脫苦的時(shí)間而發(fā)生太明顯變化，尤其是在60～100 min之內(nèi)，幾乎不變，而之后隨著脫苦時(shí)間的繼續(xù)增加，苦味值出現(xiàn)了一定的增加，這可能是脫苦時(shí)間過久導(dǎo)致β-環(huán)狀糊精分子的微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響其脫苦能力。因此選取50～70 min作為β-環(huán)狀糊精較適宜的反應(yīng)時(shí)間范圍開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4時(shí)間對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響

3.2 β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽最優(yōu)條件的確定

3.2.1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)因素β-環(huán)狀糊精對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以β-環(huán)狀糊精添加量、溫度、pH值、時(shí)間對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果的影響，設(shè)計(jì)四因素三水平，按照表2所示L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽的最佳工藝。

表2 β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

3.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

通過正交實(shí)驗(yàn)，由10位食品專業(yè)的學(xué)生（5男5女）對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，得出綜合平均感官得分（為方便計(jì)算，在表1設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，擴(kuò)展為百分制，即將大米蛋白抗氧化肽濃度為10.0%的苦味值規(guī)定為100，依此類推，共10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)苦味值），結(jié)果如表3所示。通過極差分析，得出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小順序?yàn)镃→D→B→A，即對(duì)大米蛋白抗氧化肽脫苦效果影響最大的因素是pH值，其次是時(shí)間，再次是溫度，β-環(huán)狀糊精添加量影響最?。淮送?，分析可知β-環(huán)狀糊精脫苦大米蛋白抗氧化肽的最優(yōu)配方因素組合為A2B1C2D3，即當(dāng)β-環(huán)狀糊精添加量為0.30 g每克大米蛋白抗氧化肽，溫度控制在30℃，pH 6.0，恒溫 70 min，實(shí)驗(yàn)效果最佳。

表3 大米蛋白抗氧化肽脫苦的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

（1）分別選取β-環(huán)狀糊精添加量、溫度、pH和時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后選取0.25～0.35 g的β-環(huán)狀糊精添加量范圍、30～50℃的反應(yīng)溫度范圍、5.5～6.5的反應(yīng) pH 值范圍、50～70 min的反應(yīng)時(shí)間范圍開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（2）在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化大米蛋白抗氧化肽脫苦的工藝條件為：每克大米蛋白抗氧化肽添加β-環(huán)狀糊精 0.30 g，反應(yīng)溫度 30℃，pH 6.0，反應(yīng)時(shí)間 70 min。