賈全凡，袁 龍，劉冬梅，常藝瓊

(四川省廣元市中心醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科 628000)

鼻息肉病是臨床常見的鼻部黏膜慢性炎癥，患者常因鼻腔堵塞導(dǎo)致鼻阻、頭痛等癥狀，部分患者伴哮喘、中耳炎等并發(fā)癥[1]。酪氨酸激酶JAK/轉(zhuǎn)錄因子STAT信號(hào)(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)屬于重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞生理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) 屬于核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為炎性反應(yīng)中的重要介質(zhì)[3]。近年來(lái)研究顯示，JAK/STAT、NF-κB的激活與鼻息肉的發(fā)生有著密切聯(lián)系，但具體作用機(jī)制目前尚未闡明[4]。本研究體外培養(yǎng)鼻息肉細(xì)胞，并給予西替利嗪處理，探究西替利嗪對(duì)鼻息肉細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)及NF-κB表達(dá)的影響，為鼻息肉的治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月至2017年8月在本院耳鼻喉科進(jìn)行治療的40例鼻息肉病患者為試驗(yàn)組，其中男22例，女18例，年齡23～65歲，平均(43.59±7.23)歲?；颊呓M織分型均為Ⅱ型，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期15例，Ⅲ期6例，患者均進(jìn)行手術(shù)治療獲取鼻息肉組織。另選取同期在本院進(jìn)行鼻中隔手術(shù)的27例正常中鼻甲標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男16例，女11例，年齡24～62歲，平均(43.26±8.17)歲。以上納入患者均知情同意，無(wú)哮喘、過(guò)敏性鼻炎等病史，近期1個(gè)月內(nèi)未服用抗組胺藥物或糖皮質(zhì)激素。兩組患者在性別、年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、蛋白酪氨酸激酶(Janus kinase 3，JAK3)、磷酸化JAK-3(p-JAK3)、信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、NF-κB p50、NF-κB p65抗體購(gòu)自于美國(guó)Santa Cruz公司；B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗購(gòu)自于美國(guó)R&D公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于日本Takara公司；蛋白凝膠成像儀購(gòu)自于美國(guó)Bio-Red公司；細(xì)胞流式儀購(gòu)自于美國(guó)Thermo公司。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 鼻息肉細(xì)胞原代培養(yǎng) 取出保存鼻息肉組織、正常中鼻甲組織，置于含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗后，將組織剪碎，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化液放置4 ℃冰箱中消化12～16 h，輕柔吹打組織塊，細(xì)胞脫落后，在細(xì)胞懸液中加入胎牛血清，置于離心機(jī)中1 000 r/min離心5 min，添加10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液，放置在5%CO2、1%O2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)可用于后續(xù)研究。

1.2.2.2 Western blot檢測(cè)JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65的表達(dá) 收集培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后加入蛋白裂解液反應(yīng)30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配制12%分離膠、5%濃縮膠，將蛋白樣品與Loading buffer 1∶4混勻后上樣，蛋白上樣量為20 μg，起始電壓設(shè)置為80 V。待樣品指示劑進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓升高至120 V。電泳結(jié)束后，將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，4 ℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，電壓設(shè)置80 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min。結(jié)束后用Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)溶液清洗蛋白凝膠，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉90 min。TBST溶液清洗后，加入一抗，4 ℃過(guò)夜；TBST清洗后加入二抗，室溫下孵育90 min；TBST清洗后滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液顯色，置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定 收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期鼻息肉細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液添加至96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄上清液，向孔內(nèi)加入2.5×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L西替利嗪(分別為西替利嗪低、中、高濃度組)，對(duì)照組不進(jìn)行藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，向孔內(nèi)加入20 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm處吸光度值。

1.2.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，用預(yù)冷PBS清洗2次后，加入70%乙醇溶液固定過(guò)夜，PBS清洗細(xì)胞后加入異硫氰酸熒光素(FITC)，避光下孵育20 min，與細(xì)胞流式儀中觀察細(xì)胞凋亡情況。

表1 JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65蛋白水平

a：P<0.05，與正常中鼻甲細(xì)胞比較

表2 各組鼻息肉細(xì)胞增殖水平比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較;b：P<0.05，與西替利嗪低濃度組比較;c：P<0.05，與西替利嗪中濃度組比較

1.2.2.5 細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn) 細(xì)胞處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，制備細(xì)胞爬片，PBS清洗3次，每次清洗3 min，置于4%多聚甲醛中固定15 min。PBS再次清洗3次，每次清洗3 min，隨后加入0.5%Triton X-100室溫放置20 min。PBS又清洗3次，每次清洗3 min，晾干后滴加山羊血清，室溫下封閉30 min，用濾紙吸走封閉液后滴加一抗，4 ℃過(guò)夜孵育。次日PBS清洗3次，每次清洗3 min，加入熒光二抗，37 ℃孵育1 h，避光下加入4,6-聯(lián)脒-2苯基吲哚(DAPI)孵育5 min，磷酸鹽緩沖液吐溫20(PBST)清洗4次，每次清洗5 min，晾干后置于熒光顯微鏡下觀察保存圖像。

1.2.2.6 西替利嗪對(duì)鼻息肉細(xì)胞中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65、Bcl-2、Bax的表達(dá) 西替利嗪處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后保留下層細(xì)胞沉淀，參照1.2.2.3方法進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 鼻息肉細(xì)胞及正常中鼻甲細(xì)胞中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65蛋白水平比較 兩種細(xì)胞中JAK3、STAT3蛋白水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常中鼻甲細(xì)胞相比，鼻息肉細(xì)胞中p-JAK3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65蛋白水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 西替利嗪對(duì)鼻息肉細(xì)胞增殖的影響 隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，西替利嗪各濃度組細(xì)胞抑制率逐漸升高。在同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，西替利嗪各組隨著處理劑量的升高，細(xì)胞抑制率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 西替利嗪對(duì)鼻息肉細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，西替利嗪處理組細(xì)胞凋亡率逐漸升高，且隨著處理劑量的增加逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表3。

A：對(duì)照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖1鼻息肉細(xì)胞凋亡情況

A：對(duì)照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖2 鼻息肉細(xì)胞中STAT3免疫熒光檢測(cè)(×100)

a：P<0.05，與對(duì)照組比較;b：P<0.05，與西替利嗪低濃度組比較;c：P<0.05，與西替利嗪中濃度組比較

A：對(duì)照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖3鼻息肉細(xì)胞中NF-κB p65免疫熒光檢測(cè)(×100)

2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)鼻息肉細(xì)胞中STAT3、NF-κB p65表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)顯示，STAT3、NF-κB p65在對(duì)照組細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞核中，經(jīng)西替利嗪處理后，STAT3、p65逐漸向細(xì)胞質(zhì)中移動(dòng)，隨著處理劑量的增加，細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，見圖2、3。

2.5 西替利嗪對(duì)鼻息肉細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)、NF-κB、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 4組JAK3、STAT3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，西替利嗪處理組p-JAK3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65、Bcl-2蛋白表達(dá)均降低，Bax蛋白表達(dá)升高，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、表4。

A：對(duì)照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖4 鼻息肉細(xì)胞中JAK3、p-JAK3、STAT3、

a：P<0.05，與對(duì)照組比較;b：P<0.05，與西替利嗪低濃度組比較;c：P<0.05，與西替利嗪中濃度組比較

3 討 論

抗組胺藥物為臨床治療鼻炎、過(guò)敏性鼻炎的主要藥物，第1代抗組胺藥物雖然有一定的效果，但具有嚴(yán)重毒副作用，如心臟毒性[5]。西替利嗪屬于抗組胺第2代藥物，為高選擇性H1受體拮抗劑，可選擇性與靶細(xì)胞H1受體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抗組胺作用。與第1代藥物相比，其對(duì)胃腸、心臟、頭部的不良反應(yīng)明顯減弱，且半衰期增長(zhǎng)，藥效持久，在鼻炎、過(guò)敏性鼻炎中治療效果較好[6-7]。基于此，本研究通過(guò)離體培養(yǎng)鼻息肉細(xì)胞，并給予西替利嗪處理，以觀察其對(duì)鼻息肉細(xì)胞增殖的影響及與JAK/STAT信號(hào)、NF-κB通路的關(guān)系，以探究西替利嗪作用機(jī)制。

JAK/STAT信號(hào)通路在多類細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及炎性反應(yīng)發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞因子與受體結(jié)合后形成二聚體且與JAK靠近，進(jìn)而被酪氨酸殘基磷酸化，吸引轉(zhuǎn)錄因子STAT與受體結(jié)合，使STAT磷酸化并與受體解離形成二聚體，逐漸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)參與下游靶基因的調(diào)控，因而JAK的磷酸化后能夠激活STAT磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用[8-10]。過(guò)往研究顯示在鼻息肉形成過(guò)程中炎癥細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)激活JAK進(jìn)而激活STAT3，放大炎性反應(yīng)[11]。本研究結(jié)果顯示在鼻息肉細(xì)胞中p-JAK3、p-STAT3明顯高于正常中鼻甲細(xì)胞，根據(jù)以往研究結(jié)果推測(cè)，STAT3可能與鼻息肉的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示西替利嗪處理后鼻息肉細(xì)胞增殖明顯受到抑制，且p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)降低，免疫熒光檢測(cè)顯示STAT3逐漸向細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移，表明JAK/STAT信號(hào)通路參與鼻息肉的發(fā)生，西替利嗪可通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路的磷酸化，進(jìn)而抑制鼻息肉細(xì)胞的增殖。

NF-κB屬于重要核轉(zhuǎn)錄因子，在炎性、免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，一般以p50-p65異二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)。NF-κB被激活后逐漸轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與DNA啟動(dòng)位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，NF-κB被激活后可大量分泌炎癥介質(zhì)，進(jìn)而調(diào)控多種炎癥因子表達(dá)[12-13]。CHO等[14]研究表明，鼻息肉組織中NF-κB 呈陽(yáng)性表達(dá)，其可以通過(guò)調(diào)控白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)大炎性反應(yīng)，促進(jìn)鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻息肉組織中NF-κB p50、NF-κB p65蛋白有較強(qiáng)的表達(dá)，明顯高于正常中鼻甲細(xì)胞，且經(jīng)西替利嗪處理后可明顯降低其蛋白表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)顯示西替利嗪粗粒后NF-κB逐漸向細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移，表明在鼻息肉的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的激活可能為中心環(huán)節(jié)，其激活可介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放和活化，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果提示可通過(guò)西替利嗪抑制 NF-κB 蛋白的活性，以緩解鼻息肉發(fā)展。

鼻息肉組織中存在細(xì)胞增殖、凋亡失衡，以往對(duì)鼻息肉凋亡相關(guān)研究主要集中于凋亡障礙研究上，對(duì)于鼻息肉中促進(jìn)細(xì)胞凋亡研究較少[15]。卞俊杰等[16]研究顯示鼻息肉上皮細(xì)胞中存在細(xì)胞凋亡，且通過(guò)蛋白檢測(cè)顯示鼻息肉組織中Bcl-2、Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均較高。大量研究證實(shí)凋亡有關(guān)因子Bcl-2、Bcl-xl、髓細(xì)胞白血病基因1(Mcl-1)、Survivn均為STAT3信號(hào)通路下游靶基因，STAT3可對(duì)以上凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行調(diào)控促進(jìn)細(xì)胞的增殖或凋亡，進(jìn)而參與腫瘤及其他疾病的發(fā)生[17]。YANG等[18]研究顯示通過(guò)抑制STAT3活性能夠降低抑制Bcl-2的表達(dá)。本研究顯示西替利嗪處理組p-JAK3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65、Bcl-2蛋白表達(dá)均降低，Bax蛋白表達(dá)升高，且具有劑量依賴性，表明西替利嗪處理后可抑制JAK/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)鼻息肉細(xì)胞的凋亡，提示西替利嗪可誘導(dǎo)鼻息肉細(xì)胞凋亡。

綜上所述，西替利嗪能夠抑制鼻息肉細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制JAK/STAT信號(hào)、NF-κB表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)相關(guān)。但鼻息肉病的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，所涉及的具體機(jī)制還有待后續(xù)深入研究。