■趙藝竹 張 靜 郭永鵬 趙麗紅

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193)

近年來飼用抗生素導(dǎo)致的畜產(chǎn)品抗生素殘留和細菌耐藥性等問題日益嚴峻，因此迫切需要探尋一種能取代抗生素的飼料添加劑。微生態(tài)制劑具有無殘留，無耐藥性，對環(huán)境友好等諸多優(yōu)點，并且在提高機體免疫力，促進動物生長，維持機體菌群平衡等方面效果顯著，因而對開發(fā)微生態(tài)型抗生素替代物的研究非常必要。乳酸菌是微生態(tài)制劑中常見菌種，是一類可利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性無芽孢細菌的總稱。乳酸菌是人和動物腸道內(nèi)的有益菌，且為優(yōu)勢菌群，其抑菌、促生長作用已經(jīng)有廣泛研究報道。石峰[1]從健康肉雞盲腸中篩選出一株耐膽鹽，耐酸的乳酸菌，能顯著提高肉雞日增重和降低料重比。Wang等[2]從肉仔雞盲腸內(nèi)容物中分離篩選出產(chǎn)細菌素的植物乳桿菌CLP29和屎腸球菌CLE34，二者均對沙門氏菌、大腸桿菌具有較好的抑制作用。研究表明，在飼糧中添加抗菌肽，可以增加雞腸道乳酸菌數(shù)量，為獲得能夠應(yīng)用于動物生產(chǎn)及飼料添加的優(yōu)良乳酸菌種，并為雞源乳酸菌在飼料工業(yè)中應(yīng)用提供依據(jù)[3-4]。本試驗從飼喂了抗菌肽（菌絲霉素）的肉雞腸道中分離獲得乳酸菌，擬篩選出同時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有較好抑菌活性的乳酸菌，并對其抑菌活性物質(zhì)進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

指示菌：鼠傷寒沙門氏菌CVCC14028、雞白痢沙門氏菌CVCC519、腸炎沙門氏菌CICC10467、腸炎沙門氏菌CVCC3377、金黃色葡萄球菌CVCC1882、金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌CICC23926、金黃色葡萄球菌ATCC43300、大腸桿菌K99、大腸桿菌K88、大腸桿菌987P、大腸桿菌CVCC1515。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/l、牛肉粉5.0 g/l、葡萄糖 20.0 g/l、酵母 4.0 g/l、乙酸鈉 5.0 g/l、磷酸氫二鉀2.0 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、檸檬酸三銨 2.0 g/l、硫酸錳0.05 g/l、吐溫1 ml、瓊脂粉15 g/l，121 ℃滅菌15 min；

LB培養(yǎng)基：酵母浸出物5.0 g/l、氯化鈉10.0 g/l、胰蛋白胨10.0 g/l、瓊脂粉15.0 g/l，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑與儀器

試劑：過氧化氫酶（Sigma）、蛋白酶K（Merck）、細菌全基因組提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）、乳酸菌生化鑒定管(青島海博生物)。

儀器：顯微鏡、分析天平、高壓滅菌鍋、pH計、PCR儀、電泳儀、高速冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、紫外分光光度計、電子游標(biāo)卡尺。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌分離與篩選

選擇飼喂抗菌肽（菌絲霉素）的42日齡健康肉雞，頸部放血致死，無菌采集回盲腸內(nèi)容物，將內(nèi)容物用滅菌生理鹽水梯度稀釋后，取10-3梯度稀釋液0.2 ml于固體MRS培養(yǎng)基平板上均勻涂布，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑選具有典型乳酸菌特征的單個菌落反復(fù)劃線純化得到純菌株。經(jīng)分離純化后的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，將菌液與滅菌甘油按1∶1混合置于-20℃冰箱保藏。

參考于微等[5]方法制備無細胞菌體發(fā)酵液，將活化后的菌株以2%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液4 000 r/min，離心5 min，所得上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，保存?zhèn)溆?。采用牛津杯法：以金色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌各4株為指示菌，將0.2 ml指示菌涂布于LB固體培養(yǎng)基上，后在水平放置的平皿中均勻放置3個牛津杯，將無細胞菌體發(fā)酵液0.2 ml加入牛津杯中。擴散30 min～1 h后移入生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 菌株鑒定

①菌體形態(tài)鑒定與生理生化鑒定

革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。生理生化試驗：包括糖醇發(fā)酵試驗、馬尿酸鹽水解試驗等。

②乳酸菌16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

用細菌全基因組提取試劑盒提取目標(biāo)菌株的DNA，以 27F和 1492R 為上下游引物（27F：5‘-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5‘-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’），以提取得到的 DNA為模板進行PCR擴增16S rDNA基因。20 μl反應(yīng)體系：模板 DNA 1 μL，27F，1492R各 1 μl，ddH2O 7 μl，2×Taq Mix 10 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸10 min，共30個循環(huán)72℃延伸10 min后結(jié)束。取PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收并鑒定PCR產(chǎn)物。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，最后將測得的基因序列在NCBI上進行Blast比對，確定其種屬。并利用MAGE 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 抑菌物質(zhì)的確定

將無細胞發(fā)酵上清液調(diào)至各酶最適pH值，按濃度1 mg/ml分別添加過氧化氫酶、蛋白酶K，37℃保溫2 h，后將pH值調(diào)至6.5，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌做抑菌實驗，測量抑菌圈大小。與未處理發(fā)酵液的抑菌效果進行對照。將無細胞發(fā)酵上清液80℃處理1 h，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌，測定抑菌活性，與未處理作對照，測量抑菌圈大小。

1.2.4 乳酸菌生長曲線與抑菌活性曲線的繪制

將活化12 h后的菌株以2%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣一次，測其OD600nm值，以O(shè)D600nm為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制乳酸菌生長曲線，并制備無細胞發(fā)酵上清液，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌，測量抑菌活性，以抑菌直徑為縱坐標(biāo)，繪制抑菌活性曲線[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

采用牛津杯法，選取12株革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌：金色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌各4株為指示菌，進行抑菌試驗，測定所分離乳酸菌無細胞發(fā)酵上清液抑菌直徑，篩選出對指示菌株均有較好抑制效果的2株乳酸菌LAB12和LAB19。2株乳酸菌對指示菌均有不同程度的抑制效果。結(jié)果見表1。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定與生理生化鑒定

由圖1可見，LAB12和LAB19菌落經(jīng)革蘭氏染色后，顯微鏡下呈現(xiàn)革蘭氏陽性，LAB12菌體呈圓球形，LAB19呈短桿狀，分別符合片球菌、乳桿菌的菌落形態(tài)。

表1 兩株乳酸菌的抑菌活性

圖1 菌株LAB12、LAB19菌落形態(tài)

LAB12和LAB19生理生化試驗結(jié)果如表2所示。菌株LAB12可發(fā)酵水楊苷、纖維二糖、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖。菌株LAB19可發(fā)酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、蔗糖、菊糖。結(jié)合菌落形態(tài)和革蘭氏染色觀察結(jié)果，可初步判定菌株LAB12為片球菌屬，菌株LAB19為乳桿菌屬。

表2 LAB12和LAB19生理生化特性

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定（見圖2）

運用軟件MAGE 5.0將菌株LAB12和LAB19的16S rDNA基因序列與其他菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù)抽樣)，結(jié)果如圖2所示，菌株LAB12的16S rDNA基因序列與Pediococcus acidilacticiGL16和Pediococcus acidilacticiJCM 15055的16S rDNA基因序列同源性達到了100%。因此，鑒定菌株LAB12為乳酸片球菌。菌株LAB19的16S rDNA基因序列與Lactobacillus plantarumKLDS 1.0728和Lactobacillus plantarumNWAFU1539的16S rDNA基因序列同源性達到了100%。鑒定菌株LAB19為植物乳桿菌。

圖2 16S rDNA擴增結(jié)果和基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 抑菌物質(zhì)的確定（見圖3）

用過氧化氫酶處理后的無細胞發(fā)酵上清液，以腸炎沙門氏菌CVCC3377為指示菌，不影響LAB12和LAB19發(fā)酵液的抑菌活性，加熱處理和蛋白酶K處理后抑菌活性減小，說明抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感，且熱不穩(wěn)定?？梢猿醪酱_定發(fā)酵液上清中抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。

圖3 酶處理和加熱處理后抑菌直徑

2.4 乳酸菌的生長曲線與對腸炎沙門氏菌抑菌作用曲線（見圖4）

乳酸片球菌LAB12在發(fā)酵2 h后進入對數(shù)生長期，約在18 h進入穩(wěn)定期，隨著菌體數(shù)量增加發(fā)酵液上清抑菌作用增強，22 h抑菌活性達到高峰并趨于穩(wěn)定。植物乳桿菌LAB19在發(fā)酵2 h進入對數(shù)生長期，經(jīng)約10 h快速生長后，生長速度趨于穩(wěn)定，抑菌活性也基本保持不變。兩株乳酸菌無細胞發(fā)酵液上清的抑菌活性變化趨勢與其生長趨勢基本一致。

3 討論

3.1 乳酸菌的抑菌能力

在篩選乳酸菌時，其對腸道有害菌的抑制能力是篩選的重要標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)研究多以常見病原菌為指示菌，篩選對其具有良好抑制作用的菌株。郭志杰等[7]以大腸桿菌、沙門氏菌為指示菌，得到對其均有較強抑制作用的4株乳酸菌。高擎燏[8]分離篩選了對大腸桿菌K88、K99和雞白痢沙門氏菌均有較好抑制效果的5株乳酸菌。本試驗以大腸桿菌、沙門氏菌、金色葡萄球菌為指示菌，從飼喂菌絲霉素的肉雞腸道中篩選得到了2株乳酸菌LAB12和LAB19，二者的發(fā)酵液上清對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌直徑均大于15 mm，對4株金黃色葡萄球菌的抑菌直徑在10～20 mm。所篩選得到的乳酸片球菌LAB12、植物乳桿菌LAB19能夠有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌等常見病原菌。

圖4 LAB12、LAB19的生長曲線和對腸炎沙門氏菌CVCC3377的抑菌作用曲線

3.2 乳酸菌產(chǎn)細菌素

由乳酸菌生產(chǎn)的細菌素能夠抑制腸道有害菌如沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，因此篩選得到產(chǎn)細菌素乳酸菌，對保持畜禽腸道健康及開發(fā)抗生素替代物具有重要意義。王娟等[9]篩選得到一株產(chǎn)細菌素乳酸菌，抑菌效果良好且適合腸道定植，適合用作飼料添加劑，以促進畜禽腸道健康。本試驗篩選得到兩株乳酸菌LAB12和LAB19，經(jīng)初步鑒定產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為細菌素。

3.3 乳酸菌的生長特性

乳酸菌在腸道中繁殖到一定數(shù)量時，通過調(diào)節(jié)機體腸道內(nèi)菌群平衡，促進動物健康。所篩選出的菌株應(yīng)具備優(yōu)良的生長速度和抑菌活性，才能達到較好的益生效果。因此對LAB12和LAB19兩株乳酸菌進行了生長曲線和抑菌活性曲線的繪制。LAB12在接種2 h后進入對數(shù)生長期，18 h左右進入穩(wěn)定期。22 h抑菌活性達到最大且趨于穩(wěn)定，LAB19在發(fā)酵2 h進入對數(shù)生長期，經(jīng)約10 h快速生長后，生長速度趨于穩(wěn)定，抑菌活性也基本保持不變。根據(jù)曲線的趨勢可以判斷，二者在每個時段的細菌數(shù)量與發(fā)酵液上清的抑菌直徑有對應(yīng)關(guān)系，抑菌作用隨細菌數(shù)增多而增強，與大多數(shù)研究的結(jié)果相似[10-11]。LAB12和LAB19生長速度較快，具有良好的生長特性和抑菌活性，盡管兩株菌來源相同，因菌株本身特性不同，二者的生長速度有所差異。

4 結(jié)論

本文從飼喂菌絲霉素的肉雞腸道食糜中，篩選得到2株具有較好抑菌效果的乳酸菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和16S rDNA分析確定，菌株LAB12和LAB19分別為乳酸片球菌和植物乳桿菌。通過對LAB12和LAB19發(fā)酵液上清的不同處理，初步判斷菌株所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)主要為細菌素。

本研究結(jié)果為后續(xù)對LAB12和LAB19的發(fā)酵條件的優(yōu)化、所產(chǎn)細菌素的生物學(xué)特性等研究提供依據(jù)，并為乳酸菌制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用提供可靠菌種。