張騰蛟 華 震

（北京醫(yī)院手術麻醉科 國家老年醫(yī)學中心，北京100730）

阿片類鎮(zhèn)痛藥一直是臨床控制各種中、重度疼痛的核心藥物，在過去的幾十年里隨著鎮(zhèn)痛需求的不斷增加而被越來越廣泛的使用[1]。長期、大量使用阿片類藥物，可導致藥物耐受、痛覺過敏等副作用出現(xiàn)，嚴重影響臨床使用的安全性與舒適性[1]。關于阿片類藥物耐受（阿片耐受）的發(fā)生機制和防治方法的研究報道很多，但至今沒有定論。microRNAs (miRNAs) 作為轉錄后水平調節(jié)基因表達的非編碼RNA，已被報道參與阿片耐受的發(fā)生及發(fā)展。阿片類藥物不僅可導致神經組織或細胞中多種miRNAs表達水平的變化（見表1），而且不同藥物之間還存在著miRNAs表達種類和程度的差異性[2～5]。目前還沒有關于miRNAs和阿片耐受研究進展的文獻見刊，為此本文對近年來此領域的研究進行綜述。

一、阿片耐受機制概述

阿片耐受是指長期使用阿片類藥物導致的藥物鎮(zhèn)痛效力在固定劑量下的逐漸降低，通常需要增加劑量才能維持最初的鎮(zhèn)痛水平[6]。神經系統(tǒng)內存在多種類型的阿片受體 (μ、κ、δ等)，它們均是典型的抑制性G蛋白偶聯(lián)受體[7]。μ阿片受體 (μ opioid receptors, MORs) 在中樞和周圍神經系統(tǒng)內廣泛分布，在中樞主要分布于大腦皮層、邊緣系統(tǒng)、丘腦、紋狀體、海馬、藍斑和脊髓背角的淺層等[8]。敲除MORs基因后，嗎啡等阿片類藥物不僅喪失了鎮(zhèn)痛作用，而且不再引起藥物耐受、痛覺過敏、藥物成癮等副作用，這表明MORs對于阿片類藥物的“正反”兩方面作用都是至關重要的，MORs是研究阿片耐受的核心之一[7,9]。

Corder G等[9,10]利用基因工程技術成功制備了僅在周圍神經傷害性感受器不表達MORs的小鼠（在中樞神經系統(tǒng)正常表達），長期皮下注射嗎啡后，發(fā)現(xiàn)小鼠仍保持著正常的鎮(zhèn)痛作用而沒有產生鎮(zhèn)痛耐受；將不透過血腦屏障而僅作用于外周的MORs拮抗劑甲基納曲酮溴化物 (methylnaltrexone bromide,MNB) 與嗎啡同時注射，取得了與條件性敲除小鼠相同的結果。然而，已被證實參與嗎啡耐受的小膠質細胞[10]在條件性敲除小鼠中仍然高度活化，這表明外周傷害性感受器的MORs極有可能是形成嗎啡耐受的決定性節(jié)點[9]。

MORs下調和神經適應 (neuroadaptation) 可能是阿片耐受的主要機制，MORs下調包括MORs表達減少和降解增加，神經適應包括突觸可塑性 (synaptic plasticity) 和神經可塑性 (neuroplasticity)[11]。在DNA修飾、轉錄、轉錄后等不同水平，MORs表達都有可能受到調控，miRNAs主要在轉錄后水平調控MORs表達[12]。

一般認為，阿片類藥物結合MORs后產生抑制性G蛋白信號而引起鎮(zhèn)痛作用，但包括藥物耐受、呼吸抑制和便秘等副作用可能與β-抑制蛋白-2 (β-arrestin-2) 對 MORs信號的調節(jié)有關[7,13,14]。在阿片類藥物的作用下，G蛋白偶聯(lián)受體激酶活性上調并催化MORs發(fā)生磷酸化，受體磷酸化后對β-arrestin-2的親和力增加，β-arrestin-2的募集使受體與G蛋白解偶聯(lián)即脫敏，解偶聯(lián)后受體發(fā)生內化[15,16]。內化被認為是機體為避免MORs長時間持續(xù)性激活的一種生理保護性機制，因為受體可經過循環(huán)回到細胞膜上繼續(xù)發(fā)揮作用即復敏[15]。但決定受體內化后命運的機制比較復雜，其也可能被轉運到溶酶體直接降解掉，結果是細胞表面可用受體減少導致鎮(zhèn)痛效力降低[11,16]。

長時程增強 (long-term potentiation, LTP) 是長期突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式，它是由于同步刺激兩個神經元而發(fā)生在兩個神經元信號傳輸中的一種持久的突觸強度改變現(xiàn)象[17]。LTP也被廣泛的認為參與傷害性通路的功能調節(jié)。電生理學研究證明阿片類藥物在抑制傷害性感受器和脊髓背角神經元之間傷害性信息傳遞的同時，也可能產生突觸可塑性改變，如LTP，這被認為可能有助于阿片耐受[18]。然而，LTP起源于突觸前還是突觸后是有爭議的，并且也不確定LTP是否由傷害性感受器或脊髓神經元中的MORs激活引起[18,19]。但最新的一項研究結果提示，傷害性感受器中的突觸前MORs信號導致阿片類藥物誘導的脊髓LTP[9]。

活化的小膠質細胞和星形膠質細胞被認為是阿片耐受的重要貢獻者，抑制神經膠質細胞的活化可以降低耐受性[20,21]。在機制方面，人們提出嗎啡直接或間接作用于膠質細胞的許多可能途徑，包括MORs、Toll樣受體4、ATP受體P2X3和趨化因子受體等[20～22]。但隨后的研究表明，敲除Toll樣受體4的小鼠仍然產生了嗎啡耐受[23]，神經膠質細胞中也未發(fā)現(xiàn)MORs的表達[9]?？傊?，神經細胞和神經膠質細胞在阿片耐受形成過程中的具體角色還沒有完全清楚，它們啟動阿片耐受的分子機制仍未徹底闡明。

二、miRNAs與阿片受體

1.miRNAs的一般作用

miRNAs是一種長度約20個核苷酸的非編碼RNA，在動物中主要通過與靶基因mRNA的3非翻譯區(qū) (3?-untranslated region, 3?-UTR) 部分互補結合而阻止mRNA的翻譯或使mRNA降解，在轉錄后水平上抑制靶基因表達[24]。但近年來，也有關于miRNAs激活靶mRNA、上調翻譯的報道，并認為這與細胞周期有關，即當細胞處于非增殖狀態(tài)時miRNAs可能上調靶mRNA的翻譯，否則起抑制作用[5,25]。然而，人們對這種觀點持有較大爭議，具體機制有待闡明。目前認為，miRNAs作為表觀遺傳學的重要調節(jié)因子，可以廣泛的參與調控包括神經生物反應在內的各類細胞活動，包括神經元生長、代謝、凋亡及突觸可塑性等[26]。

2.miRNAs與阿片受體的表達

隨著研究的不斷深入，人們逐漸認識到長期嗎啡治療并未在轉錄水平改變MORs的mRNA生成量，而可能是在轉錄后水平造成的MORs最終表達量的降低[27]。

早在2008年，有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-23b(miR-23b)可通過互補結合小鼠神經母細胞瘤細胞MORs的mRNA3?-UTR進而抑制mRNA裝配到核糖體上進行翻譯，進一步的實驗表明長期嗎啡處理人神經母細胞瘤細胞以劑量和時間依賴性方式增加miR-23b表達，在轉錄后水平降低MORs表達[28]。同樣用嗎啡長期處理體外培養(yǎng)的小鼠海馬神經元，miR-339-3p表達升高，miR-339-3p可以與MORs的mRNA3?-UTR上的特定序列結合，進而使mRNA穩(wěn)定性降低而衰變降解，MORs合成減少，這種情況可以被miR-339-3p抑制劑逆轉[29]。在另一項用嗎啡處理的體外研究中，也發(fā)現(xiàn)了兩種通過結合MORs的mRNA3?-UTR下調MORs表達的miRNAs-miR-212/132，認為嗎啡激活MORs后通過胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK；MAPK家族的一員）和蛋白激酶A的級聯(lián)信號通路引起環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB；一種可調節(jié)miR-212/132基因轉錄的蛋白質）的磷酸化，最終使miR-212/132表達上調30]。

大多數證據都支持嗎啡下調MORs表達的觀點，但也有不同的聲音存在。有研究報道m(xù)iR-16能夠結合到MORs的mRNA3’-UTR靶位點上并抑制MORs基因的表達，發(fā)現(xiàn)嗎啡通過抑制miR-16的表達而上調MORs水平，并且納洛酮逆轉這種作用[31]。需要說明，這一發(fā)現(xiàn)來源于CEM ×174細胞（一種淋巴細胞）的研究，與我們所要探討的神經系統(tǒng)阿片耐受有明顯區(qū)別。如果說上面的細胞水平研究不足以證明miRNAs在體內能夠調節(jié)MORs的表達，那么下面的動物模型研究可以提供更確切的證據。

人們首先發(fā)現(xiàn)let-7家族miRNAs普遍存在能和MORs的mRNA3?-UTR部分互補配對的序列，小鼠的let-7表達水平在長期嗎啡治療后顯著上調，let-7被納入RNA誘導的沉默復合物 (RNA-induced silencing complex, RISC) 中，RISC募集并隔離MORs mRNA進入缺乏翻譯機制的處理體中，從而有效地減少了與核糖體結合的mRNA，導致翻譯起始抑制、MORs表達下調，最終形成嗎啡耐受；let-7生成抑制劑有效的減輕了小鼠嗎啡耐受程度[27]。利用可卡因處理斑馬魚胚胎的研究為let-7參與MORs表達提供了更多的證據[32]。近期的一項研究通過皮下植入嗎啡顆粒誘導小鼠嗎啡耐受，發(fā)現(xiàn)miR-103和miR-107的表達水平在紋狀體中明顯升高，而在前額皮質中卻沒有明顯變化，miR-103和miR-107結合MORs的mRNA3?-UTR而阻止其裝配到核糖體上進行翻譯，參與嗎啡耐受發(fā)展；miR-103和miR-107都是由泛素激酶家族基因的內含子轉錄的，除了3?-末端有一個核苷酸不同外，這兩種miRNAs具有相同的序列并且調節(jié)重疊的目標[33]。慢性嗎啡處理后miR-103和miR-107出現(xiàn)區(qū)域差異性表達，目前還不知道這是否與MORs分布不均勻有關，還是存在其他調節(jié)機制。

至此我們可以認為，長期嗎啡治療可上調某些miRNAs的表達，后者主要與MORs的mRNA3?-UTR部分互補結合而阻止mRNA的翻譯而不是使mRNA降解，導致MORs生物合成減少、產生阿片耐受。考慮到一種miRNAs可以作用于多種靶基因而一種靶基因也可能受多種miRNAs調控[24]，同時注意到MORs的mRNA3?-UTR是一段比較長的非編碼區(qū)（人類通常由13000多個核苷酸組成）[3,4]，就可以理解MORs基因轉錄后調節(jié)的復雜性。目前尚不清楚上述多種miRNAs在阿片耐受性發(fā)展過程中的具體關聯(lián)，但既然它們都能夠和MORs的mRNA3?-UTR上不同靶點結合而調節(jié)MORs的表達，那么它們可能共同參與了阿片耐受。

3.miRNAs與阿片受體的降解

β-arrestin-2是一種G蛋白偶聯(lián)受體調節(jié)蛋白，敲除其表達基因后嗎啡鎮(zhèn)痛作用明顯增強和延長，同時大大減輕了嗎啡引起的藥物耐受、呼吸抑制和急性便秘等[13,14]。

近來有研究者對β-arrestin-2參與嗎啡耐受形成的機制做了拓展性的研究，發(fā)現(xiàn)靶向抑制βarrestin-2表達的miR-365在嗎啡耐受大鼠脊髓水平顯著下調，利用慢病毒介導的miR-365過表達有效的增強和延長了鎮(zhèn)痛作用[3]。隨后一組研究報道了相似的結果，并提出ERK/CREB是嗎啡引起miR-365下調的上游調節(jié)通路，miR-365可能還與星形膠質細胞和小膠質細胞活化有關，過表達miR-365不僅提高了嗎啡的鎮(zhèn)痛作用而且減少了膠質細胞活化相關的細胞因子釋放[35]。

然而，在此之前的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和大鼠海馬神經元在體外經嗎啡或芬太尼長期處理后miR-365的表達量上調，并提出MORs活化后經ERK通路調節(jié)多種miRNAs的差異性表達[4]。當然，這種看似矛盾的結果還需要進一步探討，這種細胞模型與嗎啡耐受動物模型的代表性差異是明顯的。也有報道提出，miR-365通過靶向調節(jié)白細胞介素-6、細胞周期蛋白D1等參與免疫應答、腫瘤生成等過程[36]，此外一種可促進星形膠質細胞向神經元轉化的轉錄因子也受miR-365靶向調節(jié)[37]。這些發(fā)現(xiàn)再次提醒我們注意miRNAs調節(jié)作用的復雜性，即一種miRNAs可能參與調控多種靶基因的表達。

三、miRNAs與神經適應

1.miRNAs與突觸可塑性

N-甲基-D-天冬氨酸受體 (N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR) 主要分布于中樞神經突觸處，腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)主要在神經系統(tǒng)內表達；NMDAR和BDNF是公認的形成LTP突觸可塑性的重要分子，它們在阿片耐受過程中扮演著重要角色[17,18,38]。有報道稱，BDNF清除劑TrkB-Fc（酪氨酸受體激酶B-Fc）能夠緩解小鼠嗎啡耐受[39]，非競爭性NMDAR拮抗劑MK-801明顯減慢了嗎啡耐受的進程[40]，但在臨床上NMDAR拮抗劑無效或有明顯神經毒性[17]。

一項通過長期嗎啡皮下注射誘導小鼠嗎啡耐受的研究報道，隨著嗎啡耐受的形成miR-219表達逐漸降低，其靶標鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 IIγ (calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIγ, CaMKIIγ) 表達逐漸升高，這種改變只發(fā)生在背根神經節(jié)中而在相對應的脊髓節(jié)段中miR-219、CaMKIIγ的表達均沒有改變；同時依賴CaMKIIγ調節(jié)的BDNF表達量也升高，上調miR-219或下調CaMKIIγ、BDNF的表達均被證實能有效的減輕小鼠的嗎啡耐受程度[39]。另一項通過長期鞘內注射嗎啡誘導大鼠嗎啡耐受的研究也得出了相似的結果，即在耐受形成過程中miR-219對CaMKII γ的靶向抑制作用減低，并提出NMDAR在miR-219介導的嗎啡耐受中表達增加，NMDAR的表達受miR-219/CaMKIIγ通路的調節(jié)[41]。令人感興趣的是，兩組研究關于miR-219的表達定位出現(xiàn)了相反的結果，后一項研究表明隨著耐受的形成miR-219在大鼠脊髓(L4-L5)中的表達逐漸降低，而前一項研究表明miR-219在小鼠脊髓 (L4-L6) 中的表達沒有改變；由于后一項研究沒有檢測大鼠背根神經節(jié)中miR-219的表達變化，所以我們不能對兩項研究做進一步的比較；這種矛盾的結果是否與動物模型、給藥方式的差異有關，還是有其他方面的原因，目前還不能得出結論。

對于嗎啡通過調節(jié)BDNF的表達導致鎮(zhèn)痛耐受，同期的另一項研究發(fā)現(xiàn)了不同的調節(jié)通路。長時間皮下注射嗎啡引起miR-375在小鼠背根神經節(jié)內逐漸降低，導致其直接靶標JAK2（Janus激酶2）表達調高，并通過JAK2/STAT3（信號轉導和轉錄激活因子3） 通路引起B(yǎng)DNF表達升高，調節(jié)這條通路上的任一節(jié)點均被證實能部分的減輕嗎啡耐受程度[42]。

上面的研究支持阿片類藥物通過miRNAs調節(jié)CaMKIIγ、BDNF和NMDAR表達，進而引起阿片耐受的觀點。BDNF是miR-1眾所周知的靶標之一，神經病理性疼痛大鼠背根神經節(jié)中miR-1下調后，引起B(yǎng)DNF的高表達，被認為是痛覺過敏和異常疼痛的主要原因[43]。令人感興趣的是，miR-1被發(fā)現(xiàn)在嗎啡耐受小鼠前額皮質中下調[5]，這提示我們BDNF參與阿片耐受可能是miR-1直接調節(jié)的。此外有證據表明，神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞在阿片類藥物的刺激下均可能分泌BDNF，后者又調節(jié)了NMDAR的表達[38,44]?？偨Y來看，CaMKIIγ、BDNF和NMDAR三者誘導LTP的相互關系可能是：長時間激活的MORs引起神經突觸處Ca2+上調和Ca2+/CaMKIIγ信號通路活化，接著觸發(fā)BDNF的釋放；BDNF一方面通過下游信號傳導誘發(fā)LTP，另一方面又上調了NMDAR的表達；NMDAR信號通路活化直接誘導LTP，同時也能上調Ca2+和活化Ca2+/CaMKIIγ信號通路，最終形成CaMKIIγ、BDNF和NMDAR三者相互促進的回路，可能有多種miRNAs參與調節(jié)這一回路[17,19,44]。

2.miRNAs與神經可塑性

長期使用阿片類藥物導致的樹突棘和軸突棘數量或結構的改變，被認為參與了阿片耐受的形成。絲氨酸蛋白酶抑制劑-1 (serpin peptidase inhibitor clade I, Serpini1) 是一種生物體內可增加樹突棘密度的絲氨酸蛋白酶活性調節(jié)劑，有研究發(fā)現(xiàn)調節(jié)其表達的miR-27a在嗎啡耐受小鼠前額皮質內顯著降低，與一般的miRNAs不同的是miR-27a在轉錄后水平正向調節(jié)Serpini1的翻譯，長期注射嗎啡時Serpini1表達減低進而使小鼠前額皮質內樹突棘密度減小導致嗎啡耐受[5]。

miR-133b被認為可促進神經元軸突突起的生成和調節(jié)神經可塑性[45]。有研究者利用體外培養(yǎng)的大鼠海馬組織探究慢性嗎啡處理對神經元分化的可能影響，提出嗎啡激活MORs后通過ERK通路調節(jié)miR-133b的表達，發(fā)現(xiàn)miR-133b在海馬神經元中表達下調，最終引起神經突觸信號傳導異常[45]。

神經分化因子1 (neurogenic differentiation 1, Neurod1) 是一種參與神經元發(fā)育分化的重要轉錄因子，活化的Neurod1可能有助于樹突棘穩(wěn)定性、成體神經發(fā)生、學習和記憶等[46]。有研究比較了嗎啡和芬太尼通過結合MORs而影響Neurod1的機制差異性，發(fā)現(xiàn)二者均能通過抑制CaMKIIα活性來降低Neurod1的磷酸化水平（即活化），然而芬太尼還可以通過ERK通路抑制小鼠海馬組織中miR-190的表達來增加Neurod1水平，因為miR-190在轉錄后水平負向調節(jié)神經分化因子1的表達；但嗎啡卻沒有改變miR-190的表達，最終效應就是嗎啡可降低Neurod1的總體活性水平，而芬太尼可將其維持在基礎水平[46]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡比芬太尼具有更高的誘導小鼠藥物耐受的能力，這可能與二者調節(jié)miR-190表達的差異性有關；并提出嗎啡降低Neurod1的活性水平進而可能通過降低樹突棘穩(wěn)定性、抑制成體神經發(fā)生誘導小鼠鎮(zhèn)痛耐受產生，過表達Neurod1可以使嗎啡誘導耐受能力下降[47]。

此外，有報道稱miR-124和miR-19b也靶向調節(jié)Neurod1的表達[46]。有證據表明，體外培養(yǎng)的人神經祖細胞在補充外源性miR-124后，神經元分化和谷氨酸轉運體表達的水平提高[48]。另有研究表明小鼠發(fā)生炎性或病理性神經痛時，腦組織和脊髓中miR-124水平降低并引起小膠質細胞活化，導致持續(xù)性的痛覺過敏，鞘內注射miR-124可降低痛覺過敏程度[49]。鑒于嗎啡耐受和痛覺過敏可能存在相似的發(fā)生機制[50]，例如小膠質細胞的活化，推測miR-124可能參與了鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)生。一項針對小鼠前額皮質的miRNAs表達譜分析顯示，嗎啡耐受后miR-19b水平下調[5]，但目前還未見到miR-19b參與調節(jié)傷害性傳導通路的詳細報道。

四、結語

阿片類藥物通過激活MORs，一方面產生抑制性G蛋白信號而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；另一方面可活化ERK/CREB等信號通路引起多種miRNAs表達變化，繼而導致MORs下調和神經適應等。miRNAs為揭示阿片耐受機制和防治阿片副作用提供了新的切入點，但也面臨著諸多問題。首先，阿片類藥物可以引起機體多種miRNAs上調或下調，這些miRNAs有的被證實參與了阿片耐受，有的可能發(fā)揮著調節(jié)鎮(zhèn)痛等有益作用，有的可能介導了其他不利作用；不同阿片類藥物調節(jié)miRNAs的能力存在差異性，此外還有明顯的組織細胞表達差異，這就需要進一步鑒別出那些調節(jié)阿片耐受的代表性miRNAs。其次，一種miRNAs可以調節(jié)多種靶基因表達，而一種靶基因也可能受多種miRNAs調控。這種多樣性使得在將miRNAs用于臨床診斷和治療時，不得不面對診斷特異性和治療副作用等問題。此外，在研究將miRNAs作為防治阿片耐受的靶點時，還要考慮轉運載體的選擇，納米粒、外泌體等可能是未來的研究方向。總而言之，miRNAs參與阿片耐受的機制是復雜的，把miRNAs作為干預阿片耐受的靶點還將面臨著許多挑戰(zhàn)。