吳明順 周伏圣 張學(xué)軍

表觀遺傳學(xué)是指DNA序列不發(fā)生改變的情況下，可調(diào)控基因表達(dá)的一種可遺傳的改變，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等。研究表明，表觀遺傳學(xué)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也是常見皮膚病免疫調(diào)節(jié)的重要機(jī)制之一[1,2]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容，本文介紹T細(xì)胞DNA甲基化與免疫相關(guān)性皮膚病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是生物體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳修飾方式之一[3]，其主要存在方式包括:5-胞嘧啶甲基化(5-mC)，5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)和5-胞嘧啶甲酰(5-formylcytosine，5-fC)。人類中最廣泛存在的表觀遺傳修飾是胞嘧啶甲基化[4]。近期研究表明越來越多的人類疾病與DNA甲基化有關(guān)[6]，如腫瘤、2型糖尿病、癡呆等[6-8]。其中人類初級細(xì)胞和癌細(xì)胞的比較也發(fā)現(xiàn)了多個差異性甲基化區(qū)域， DNA甲基化在胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因印記和染色體穩(wěn)定性方面具有重要的調(diào)控作用，特別是最近對哺乳動物基因組多個序列CpG甲基化分布分析發(fā)現(xiàn)DNA甲基化和去甲基化維持在生殖細(xì)胞和早期胚胎中的新模式，這將進(jìn)一步解釋哺乳動物基因組甲基化模式維持的新機(jī)制[9-11]。研究還發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變通常與基因組標(biāo)記相關(guān)，包括轉(zhuǎn)錄起始位點和內(nèi)含子-外顯子連接處，而甲基化連同特定的組蛋白標(biāo)記富集在外顯子區(qū)域表明染色質(zhì)狀態(tài)可預(yù)示成熟mRNA的含量[10,12]。隨著表觀遺傳學(xué)研究的不斷進(jìn)展，利用甲基化芯片技術(shù)測序、甲基化免疫共沉淀測序和BS(Bisulfite Sequencing)等方法可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)及驗證人類疾病基因組中DNA甲基化位點差異，這將為早期疾病進(jìn)展預(yù)測及與表達(dá)遺傳調(diào)控關(guān)聯(lián)研究提供了有利的平臺。

2 皮膚病與T細(xì)胞DNA甲基化

皮膚是人體與外界接觸的最重要的屏障組織，不斷受到各種外來因素的攻擊，皮膚組織的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是抵抗外界入侵的重要方式。研究表明與常見的免疫相關(guān)性皮膚病相關(guān)的T細(xì)胞包括細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)、CD4+T細(xì)胞(Th1、Th2、Th22、Th17、Th9、Tfh和Treg細(xì)胞)[13-15]，他們通過多種方式(如甲基化修飾、細(xì)胞因子活化、基因通路異常)參與疾病相關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)[16-21]。而其中T細(xì)胞DNA甲基化在免疫性皮膚病中的調(diào)控作用是從基因水平上進(jìn)行深入研究的，這將有利于從遺傳角度來對疾病進(jìn)行多因素評估。以下主要針對常見的幾種皮膚性疾病T細(xì)胞DNA甲基化予以綜述[15]。

2.1 銀屑病與T細(xì)胞DNA甲基化 銀屑病是炎性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)性皮膚病，累及世界人口的2%～3%，美國和加拿大中患病率較高(分別為4.6%～4.7%)，而在非洲、亞洲人群中則為0.4%～0.7%[22,23]。近幾年對銀屑病DNA甲基化表達(dá)遺傳調(diào)控的研究越來越廣泛。2013年國內(nèi)的陸前進(jìn)團(tuán)隊利用免疫共沉淀測序技術(shù)進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了多個差異性甲基化區(qū)域，其中高甲基化驗證基因PDCD5和TIMP2低表達(dá)，而后張學(xué)軍團(tuán)隊又發(fā)現(xiàn)了9個新的差異性甲基化位點，其基因CYP2S1、ECE1、 EIF2C2、MAN1C1、和 DLGAP4表達(dá)與甲基化成負(fù)相關(guān)，該團(tuán)隊同時利用全基因甲基化數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化可以控制基因遺傳變異[26-28]。而對于免疫性CD4+T細(xì)胞在初始CD4+T細(xì)胞的極化期間，其DNA甲基化在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中也起著重要作用[29,30]。2012年，Han等[31]研究銀屑病患者初始CD4+T細(xì)胞全基因組DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，銀屑病患者初始CD4+T細(xì)胞在10個不同染色體基因組范圍大小從10到70 kb的26個區(qū)域里表現(xiàn)出明顯的低甲基化，而在X染色體上121個基因(包括SLITRK4、EMD、ZIC3、CXorf40A、HDAC6、IKBK等)的啟動子區(qū)域表現(xiàn)出顯著性的高甲基化水平。這些變化意味著初始CD4+T細(xì)胞可能易于在遇到抗原之前誘發(fā)銀屑病，這可能跟不同的環(huán)境因素有關(guān)，而銀屑病受環(huán)境因素影響從而引起DNA甲基化變化。之后Park等[32]發(fā)現(xiàn)銀屑病患者CD4+T細(xì)胞甲基化值偏高，特別是在啟動子區(qū)域，同時從該啟動子區(qū)域高甲基化基因中挑選表達(dá)水平降低的基因(PPAPDC3、TP73、FANK1和CATSPER2)進(jìn)行抑制劑-5-氮雜胞苷處理，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平上升。表明銀屑病患者CD4+T細(xì)胞DNA甲基化參與調(diào)控基因表達(dá)，從而參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制。Gervin等[33]分析患銀屑病的同卵雙生子在CD4+T和CD8+T細(xì)胞水平上DNA甲基化和基因表達(dá)水平差異性并作比較。對患病雙生子和未患病雙生子CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞DNA甲基化和基因表達(dá)綜合分析發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化差異與基因表達(dá)差異具有顯著相關(guān)性的基因(如LDHC、IL13、TNFSF11、MGC3207、CSF2、GIMAP5、GIMAP1、PTHLH、ALOX5AP)，這其中與銀屑病相關(guān)的基因(IL13、TNFSF11、PTHLH、ALOX5AP )富集于CD4+T細(xì)胞中。該基因DNA甲基化在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)和參與銀屑病信號通路方面也非常重要。研究還發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，銀屑病患者FOXP3 Treg特異性去甲基化區(qū)域高度甲基化，這種FOXP3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，它的表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平呈正相關(guān)[34]。以上研究均表明銀屑病患者T細(xì)胞甲基化可能通過調(diào)控基因表達(dá)從而影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展。

2.2 系統(tǒng)性紅斑狼瘡與T細(xì)胞DNA甲基化 SLE是一種累及多個器官系統(tǒng)的復(fù)發(fā)性自身免疫性疾病，其中自身反應(yīng)性T細(xì)胞在SLE的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[35]。2013年，Coit等[36]研究了SLE患者和健康對照初始CD4+T細(xì)胞甲基化水平差異，結(jié)果在SLE患者初始CD4+T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了47個特異性基因中的86個差異性甲基化位點，其中大多數(shù)處于低甲基化。研究又發(fā)現(xiàn)在這些低甲基化位點中富集了一些干擾素調(diào)控基因，包括IFIT1、IFIT3、MX1、STAT1、IFI44L、USP18、TRIM22 和 BST2，而這些低甲基化干擾素調(diào)控基因卻與疾病活動無關(guān)。此外，存在于SLE疾病活動期和靜止期的干擾素相關(guān)變化表明了表觀遺傳介導(dǎo)的干擾素變化引發(fā)的超敏反應(yīng)持續(xù)時間要超過疾病的急性期，而這些初始T細(xì)胞中的干擾素引發(fā)的超敏反應(yīng)則表明SLE患者表觀遺傳學(xué)狀態(tài)存在于祖細(xì)胞群體中[37]。后來的研究發(fā)現(xiàn)與SLE疾病活動性負(fù)相關(guān)的甲基化位點富集于染色體Chr3、Chr17、Chr1，該位點也富含轉(zhuǎn)錄因子BATF、FOS、CEBPB、JUN和STAT3；而與疾病活動正相關(guān)的位點則富集于含抑制性轉(zhuǎn)錄因子EZH2和SUZ12的X染色體上。其中關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子EZH2在活動性SLE患者CD4+T細(xì)胞表觀遺傳構(gòu)象變化方面起著關(guān)鍵作用[38]。研究初始T細(xì)胞甲基化是為了更好的發(fā)現(xiàn)與狼瘡發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的T細(xì)胞表觀遺傳學(xué)變化，從而使導(dǎo)致疾病的環(huán)境影響因素和成熟T細(xì)胞刺激影響最小化[39]。Zhao等[40]采用hMeDIP-Chip研究5-hmC在特定的基因組位點的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)具有高水平5-hmC的2748個基因存在于SLE CD4+T細(xì)胞啟動子區(qū)域，而這些基因明顯富集在神經(jīng)營養(yǎng)因子、WNT、MAPK、鈣和mTOR信號通路中。這表明啟動子區(qū)域中高DNA羥甲基化可能在SLE致病機(jī)制中非常重要。研究還發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，狼瘡患者CD4+T細(xì)胞中DNA羥甲基化水平顯著增加，可是并沒有發(fā)現(xiàn)這種羥甲基化水平與疾病活動性有關(guān)，但卻與DNA去甲基化有關(guān)；Zhao等[41]研究還發(fā)現(xiàn)了與SLE患者不同臨床表型相關(guān)的CD4+T細(xì)胞特異性DNA甲基化變化，這些變化存在于低甲基化高表達(dá)的新型靶向基因NLRP2、CD300LB、S1PR3，以及一些關(guān)鍵通路(黏附連接和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移)。另有研究發(fā)現(xiàn)，活動性SLE患者FOXP3 TSDR高度甲基化，并且pSTAT5a表達(dá)水平顯著增加，這些都與SLE疾病的活動性直接相關(guān)[34,42]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在SLE發(fā)病機(jī)制中也可能發(fā)揮著重要的作用[43]。以上表明SLE患者T細(xì)胞甲基化或者羥甲基化可能通過影響基因轉(zhuǎn)錄水平以及基因通路從而影響疾病活動性及進(jìn)展。

2.3 系統(tǒng)性硬皮病及原發(fā)性干燥綜合征與T細(xì)胞DNA甲基化 SSc及pSS都是病因及機(jī)制不明的涉及多因素的自身免疫性結(jié)締組織病，而T細(xì)胞在該類病發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用，其中T細(xì)胞甲基化尤為重要。Lei等[44]研究了SSc患者CD4+T細(xì)胞整體基因組甲基化狀態(tài)及其相關(guān)基因調(diào)控表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，SSc患者CD4+T細(xì)胞中全基因組DNA低甲基化，并且DNMT1、MBD4及MBD3基因所表達(dá)的mRNA水平明顯下調(diào)。而存在于該細(xì)胞的TNFSF7(CD70)基因啟動子區(qū)域的低甲基化與該基因的高表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[45]。研究還發(fā)現(xiàn)SSc患者CD4+T細(xì)胞中的FOXP3基因表達(dá)水平降低，該基因調(diào)節(jié)序列的高甲基化與SSc患者的FOXP3 mRNA表達(dá)水平也呈負(fù)相關(guān)性[46]。這種基因甲基化狀態(tài)抑制表達(dá)可能導(dǎo)致基因通路的異?；罨?，進(jìn)而影響疾病免疫穩(wěn)態(tài)。另有研究結(jié)果表明女性患者CD4+T細(xì)胞表面CD40L高表達(dá)，其DNA調(diào)節(jié)序列低甲基化，二者負(fù)關(guān)聯(lián)，但這種差異在男性中卻不存在[47]。對于pSS，Yin等[48]研究了pSS患者CD4+T細(xì)胞中易感基因甲基化表達(dá)水平及調(diào)節(jié)序列甲基化狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，pSS患者CD4+T細(xì)胞CD70基因啟動子低甲基化，其mRNA表達(dá)水平顯著增高，其中Perforin基因的mRNA水平也顯著增高。這些研究結(jié)果表明了SSc和pSS患者CD4+T細(xì)胞甲基化狀態(tài)及其相關(guān)易感基因過表達(dá)可能在二者的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

3 問題和展望

目前免疫-表觀遺傳學(xué)越來越成為國內(nèi)外研究皮膚病發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，但對免疫細(xì)胞(尤其是免疫性T細(xì)胞)甲基化與疑難性皮膚病如銀屑病、SLE、SSc、pSS的關(guān)系認(rèn)識還不夠廣泛和深入。由于免疫性T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多、功能最復(fù)雜的一類細(xì)胞，而DNA甲基化又是一個由多種酶促反應(yīng)參與的重要的表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制，DNA甲基化對基因表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用，廣泛研究T細(xì)胞甲基化可更深入了解皮膚病相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、為藥物靶向作用和臨床應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)，DNA甲基化和DNA羥甲基化在疾病機(jī)制方面的研究貢獻(xiàn)也值得進(jìn)一步推進(jìn)。