江中洪 江玉娥 曾茂森

尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)是人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染外生殖器、肛周等部位引起的一種常見(jiàn)的、易復(fù)發(fā)的性傳播疾病。許多研究表明，CA的發(fā)生、消退、復(fù)發(fā)及癌變與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。泌乳素(prolactin, PRL)是垂體前葉分泌的多肽激素，皮膚是垂體外PRL的重要合成及靶向器官，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、免疫應(yīng)答等生理過(guò)程。本研究采用化學(xué)發(fā)光法和免疫組化檢測(cè)CA患者外周血PRL以及皮損泌乳素受體(prolactin receptor, PRLR)的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年6月至2018年6月在我院皮膚性病科和婦產(chǎn)科就診的尖銳濕疣患者共40例，均符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》中尖銳濕疣的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。男、女各20例，年齡18～38歲，平均(24.3±4.2)歲，患者1年內(nèi)均未接受免疫抑制劑治療，排除口服大量雌激素、避孕藥、妊娠及哺乳期婦女，且無(wú)嚴(yán)重心肝腎疾病、腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及其他感染性疾病。對(duì)照組包皮組織和外周血PRL取自健康男性20名，平均(20.4±7.2)歲，由皮膚外科和泌尿外科提供，另再抽取非孕期健康女性20名外周血PRL作為對(duì)照組。所有皮膚和皮損標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋并連續(xù)切片。兩組在年齡構(gòu)成(t=0.49,P=0.72)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器和試劑 Access2化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman coulter公司，PRL試劑購(gòu)自羅氏公司，BX51-P雙目電子顯微鏡購(gòu)自日本Olympus株式會(huì)社，兔抗人PRLR抗體購(gòu)自武漢博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 PRL檢測(cè) 所有入選對(duì)象均用干燥管收集外周血3ml，及時(shí)分離血清檢測(cè)，由檢驗(yàn)科按操作常規(guī)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 免疫組化SP法 采用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(SP法)進(jìn)行檢測(cè)，接試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。手術(shù)取尖銳濕疣皮損和對(duì)照組包皮組織，4%甲醛液固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片。切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原120℃修復(fù)3 min，正常山羊血清封閉10 min，加入一抗37℃孵育1 h，生物素標(biāo)記的二抗和鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶(SP)復(fù)合物各在37℃溫箱孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。用PBS代替一抗作空白對(duì)照。

1.3.3 結(jié)果判定[2]免疫組化染色以胞質(zhì)或胞膜棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度和百分比確定PRLR表達(dá)的半定量分級(jí)：①按細(xì)胞著色強(qiáng)度,無(wú)色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；②按陽(yáng)性細(xì)胞百分比，≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。據(jù)上述兩項(xiàng)分值的乘積，0為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，6～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。采取單盲法，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍(×400)視野，取其得分的平均數(shù)判斷該標(biāo)本的半定量等級(jí)，表達(dá)陽(yáng)性率：表達(dá)陽(yáng)性率=陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)/總標(biāo)本數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血PRL在尖銳濕疣患者和對(duì)照組的表達(dá)比較 本院PRL參考值男性為(4.04～15.20)ng/mL，非孕期女性為(4.79～23.30)ng/mL，本次實(shí)驗(yàn)?zāi)行訡A患者PRL為(9.24±4.68)ng/mL，健康男性對(duì)照組為(8.42±3.83)ng/mL，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.606,P=0.548)，女性CA患者為(14.62±6.23)ng/mL，健康女性對(duì)照組為(12.42±5.46)ng/mL，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.188,P=0.242)，見(jiàn)表1。

表1 各組PRL表達(dá)水平比較(ng/mL)

2.2 PRLR在尖銳濕疣皮損和正常包皮組織中的表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 PRLR在CA組和包皮組皮損表達(dá)情況(例)

PRLR在尖銳濕疣皮損有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，PRLR受體陽(yáng)性細(xì)胞集中分布于基底層、棘層細(xì)胞下部，中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在角質(zhì)層細(xì)胞較少表達(dá)。疣體血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見(jiàn)到中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。在20名健康者的包皮組織PRLR受體呈弱陽(yáng)性表達(dá)或不表達(dá)，分布于基底層細(xì)胞和棘層細(xì)胞 (圖2)。CA患者PRLR受體陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(χ2=33.35，P=0.00)。

圖1 a,b,c在基底層及基層下部細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜被染成棕黃色(SP，×200)

圖2 a,b,c在基底層及基層下部細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜被染成淺棕黃色(SP，×200)

3 討論

PRL由199個(gè)氨基酸組成的23kDa單鏈蛋白，由于翻譯后加工、修飾的不同，23 kDa的 PRL經(jīng)蛋白水解切割后可生成14kDa、17kDa及22 kDa的變異型，在血清中PRL多以單體形式存在，也可形成二聚體、三聚體。PRL主要的功能是在妊娠期和哺乳期促進(jìn)乳腺發(fā)育，乳汁合成和乳汁分泌的維持[3]。PRLR是造血細(xì)胞因子受體超家族成員，包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，幾乎存在于所有的組織和器官。由于選擇轉(zhuǎn)錄和翻譯不同，PRLR主要包括2個(gè)亞型:長(zhǎng)型分子量為87 kDa，對(duì)PRL 親和力較高；短型分子量為36 kDa，對(duì)PRL親和力較低。這些同種型具有相同的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，但細(xì)胞內(nèi)部分的大小和序列可能不同；此外，還有一種可溶性PRLR(PRL結(jié)合蛋白)，只含有膜受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在人體中發(fā)現(xiàn)的PRLR的主要同種型是長(zhǎng)型，人PRLR除與PRL結(jié)合， PRLR還可以結(jié)合胎盤(pán)催乳素和生長(zhǎng)激素[4]。

PRL與膜受體PRLR結(jié)合形成三聚體，通過(guò)激活JAK2/STAT5、c-Src、PI3K/AKT、MAPK、Nek3-vav2-Racl等信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。PRL及PRLR表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞、皮膚附屬器、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及免疫細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、毛囊周期、免疫應(yīng)答等生理過(guò)程[5]。與垂體不同的是皮膚細(xì)胞中PRL及其受體表達(dá)主要受P物質(zhì)、IFN-γ及TNF-α等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[1，3]。

在表皮中PRL及PRLR主要表達(dá)于基底細(xì)胞層，PRL可促進(jìn)表皮KC增殖，在體外培養(yǎng)皮膚KC中，PRLR表達(dá)與KC分化程度有關(guān)[6]。在皮膚免疫系統(tǒng)中，真皮T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均可表達(dá)PRLR，PRL可促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞增殖，抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡[7]。PRL可促進(jìn)B細(xì)胞的抗原反應(yīng)性、免疫球蛋白和自身抗體產(chǎn)生，增加Th-1細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2，PRL可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-2發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。PRL還可通過(guò)增加IFN-α分泌，影響朗格漢斯細(xì)胞的遷移、抗原提呈功能，在免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色[9]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)PRL，PRL可以通過(guò)上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞刺激血管生成因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。PRL及其變異型在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成中起重要作用，23 kDa PRL可刺激血管形成，而16 kDa PRL通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，抑制其增殖和促進(jìn)凋亡，被稱為血管抑制素，還可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，收縮血管降低血管通透性，而且對(duì)腫瘤的發(fā)生有抑制作用[10]。

有研究者對(duì)頑固性復(fù)發(fā)的合并有高泌乳素(HPL)血癥的女性CA患者，通過(guò)口服溴隱亭降低血泌乳素水平后，CA的復(fù)發(fā)明顯減少[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRLR受體陽(yáng)性細(xì)胞集中分布于基底層、棘層細(xì)胞下部，中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在角質(zhì)層細(xì)胞較少表達(dá)，提示PRL可刺激基底層細(xì)胞的增殖；同時(shí)，疣體血管內(nèi)皮也可見(jiàn)PRLR的中到強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，提示PRL在血管的增殖和形成中起重要作用。但在患者外周血中檢測(cè)PRL，較健康對(duì)照組稍高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，部分復(fù)發(fā)性CA患者PRL升高較為明顯，與頑固性復(fù)發(fā)的合并有高泌乳素血癥的女性CA患者不同的是，本研究中僅僅是部分復(fù)發(fā)性CA患者PRL升高較為明顯，推測(cè)患者皮損PRLR表達(dá)的增強(qiáng)，可能與HPV促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化有關(guān)，或者是PRLR表型的表達(dá)出現(xiàn)變異有關(guān)，與PRL的結(jié)合力發(fā)生增強(qiáng)，其中的機(jī)制值得進(jìn)一步探討。