黃 丹 鞠 梅 陳 崑 吳敏智 顧 恒

近年來研究發(fā)現(xiàn)，外源因素誘導的氧化應(yīng)激在致皮膚毒性過程中起著關(guān)鍵作用，導致多種皮膚疾病的發(fā)生，比如衰老、皮膚腫瘤、免疫性皮膚病等[1]。LA是類似于維生素B族的一種抗氧化劑，存在于線粒體，具有脂溶性和水溶性，外界補充的LA可到達細胞的任何一個部位，有極強的抗炎以及自由基清除能力，有較好的應(yīng)用前景[2]。近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于糖代謝、糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管和其他多種疾病，但在皮膚科疾病中應(yīng)用較少，為了解該抗氧化劑能否對人皮膚光損傷產(chǎn)生保護作用而設(shè)計了該研究。本研究用UVB制造氧化應(yīng)激模型，探討LA對紫外線誘導的角質(zhì)形成細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。本研究采用過氧化氫來誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)[3,4]，建立人皮膚細胞的氧化應(yīng)激陽性對照。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑 細胞標本：原代角質(zhì)形成細胞取自健康成人包皮環(huán)切術(shù)后的包皮。主要試劑：單丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine, MDC)、MTT、LA、3%過氧化氫溶液、DCFH-DA熒光探針(美國Sigma-Aldrich公司)。胎牛血清(Gibico公司，烏拉圭)，角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)基(KSFM，美國Gibco公司)，MDA、TAOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)，RPMI裂解液(碧云天生物公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 UVB輻照儀(上海希格瑪高技術(shù)有限公司)，UVB熒光燈管(UVB Broadband PL-S 9W/12，美國飛利浦公司)，全波長酶標儀(美國Thermo公司)，流式細胞儀(BD FACSVerseTM Flow Cytometer，美國Bio-Rad公司)，微量高速冷凍離心機(5810R，德國Eppendorf公司)，超聲細胞破碎儀(Vcx-130，美國Soics公司)，PK-SB型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 原代KC培養(yǎng)于KSFM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中孵育。取第3～8代對數(shù)生長期細胞按(5～8)×104/mL密度接種到相應(yīng)的培養(yǎng)皿。

1.2.2 實驗分組及處理 預(yù)實驗中UVB照射分5、10、20、40和80 mJ/cm25個劑量梯度，H2O2分為0、0.5、1.0和10.0 mmol/L四個濃度梯度，根據(jù)細胞狀態(tài)及生長活力，選取UVB 40 mJ/cm2作為照射組，H2O210.0 mmol/L作為陽性對照組，以及陰性對照組，共三個組別。照射組又分為兩個亞組：一組在照射結(jié)束后加入正常培養(yǎng)基，一組加入含LA終濃度0.5 mmol/L的培養(yǎng)基孵育，分別在4 h、12 h收集細胞進行相應(yīng)檢測。陽性對照組H2O2孵育4 h、12 h后進行相應(yīng)檢測。

1.2.3 制作UVB光損傷細胞模型 細胞接種在6孔板上，每孔1.5 mL細胞懸液，搖晃均勻，置于5% CO2孵箱37℃下孵育，約12 h后細胞貼壁，待細胞增殖鋪滿80%～90%培養(yǎng)皿底時進行UVB照射處理。照射前用槍頭吸去上清，預(yù)熱的PBS緩沖液沖洗一遍，每孔加入適量PBS，使薄層液體覆蓋細胞。使用本課題組定制的UVB細胞照射裝置，光源選用平行布置的9支飛利浦寬波UVB熒光燈管(Philips UVB Broadband PL-S 9W/12)。照射前打開光源預(yù)熱10 min，使輸出光源能量穩(wěn)定，經(jīng)UVB輻照儀測量校訂，選取輻照強度相對最為均衡的照射平面(距熒光燈管16 cm處)，平均輻照強度通常在1.50 mW/cm2左右。根據(jù)需要的照射量計算出照射時間，設(shè)置時間，開始照光，照射結(jié)束后吸去PBS。照射時周圍的孔用遮光紙完全遮蓋。陰性對照孔除不照光，其他處理同照射組。

1.2.4 H2O2制作陽性對照：細胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%～90%時加入含10 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基，分別在重新孵育后4、12 h終止孵育，PBS清洗兩遍，進行下一步處理。

1.2.5 LA干預(yù) LA干粉加入無水乙醇配成0.5 mol/L的母液，分裝4℃保存，使用時按照1∶1000直接用培養(yǎng)基稀釋成終濃度500 μmol/L的試驗用終濃度。

1.2.6 2’7’-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)染色測定活性氧自由基(ROS) 去除培養(yǎng)基，加入稀釋好的DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmmol/L，37℃孵箱里孵育30 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，用胰酶將細胞消化下來。DCFH被細胞內(nèi)的ROS氧化成高熒光強度的DCF(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein)，流式細胞儀檢測該熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強度的變化，并用流式細胞術(shù)對綠色熒光進行定量。

1.2.7 化學法檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA和TAOC 預(yù)冷PBS洗滌細胞兩次，RPMI裂解液于冰上裂解細胞，10000 rpm離心10 min，取上清液，-20℃保存待測，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

1.2.8.1 觀察指標 倒置熒光顯微鏡下動態(tài)觀察各組細胞形態(tài)以及DCFH-DA染色后熒光強度變化，并用配套的成像拍照設(shè)備拍攝圖片。綠色熒光定量、MDA和TAOC濃度均以計量資料體現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 UVB照射后角質(zhì)形成細胞形態(tài)變化

2.1.1 UVB照射 原代角質(zhì)形成細胞經(jīng)照射后，較陰性對照組細胞，漂浮死亡的細胞逐漸增多，貼壁的細胞部分失去正常的膜結(jié)構(gòu)，折光度變差?？傮w上照射后12 h的細胞形態(tài)較4 h有所恢復(fù)。見圖1a～1c。

2.1.2 H2O2孵育 經(jīng)10 mmol/L H2O2作用4 h后細胞間隙增寬、死亡的細胞增多，作用到12 h細胞密度又恢復(fù)正常，但細胞輪廓欠清，有較多漂浮死亡的細胞。見圖1d～1f。

2.2 DCF-DA染色法及流式細胞術(shù)檢測ROS產(chǎn)生水平 40 mJ/cm2UVB照射后4 h細胞綠色熒光強度較對照組增強，提示ROS產(chǎn)生增多，照射后即刻加LA孵育4 h后肉眼見熒光強度有所減弱，但仍較對照組強。見圖2。流式細胞術(shù)檢測綠色熒光強度，照射后4 h，細胞的熒光強度與H2O2陽性對照相當[(35311±3072.3) vs. (37075±2049.8)]，均較陰性對照組明顯升高(24465±2085.3,P<0.001)，加LA干預(yù)后熒光強度下降至接近陰性對照組水平(26926±3502.7,P>0.05)，提示ROS產(chǎn)生減少。

從圖3看出，UVB照射后12 h，即使未使用LA干預(yù)，熒光強度較照射后4 h也有較顯著的下降(P=0.006)，加抗氧化劑LA孵育后熒光值較未加抗氧化劑差別仍有統(tǒng)計學意義[(28253.33±2288.0)vs. (24500±2203.20),P=0.002]。單因素方差分析顯示除陽性對照組與陰性對照組有顯著差異外(P<0.001)，其余組與陰性對照組均無顯著性差異。見表1。

2.3 MDA檢測結(jié)果 各組及各時間點MDA的趨勢與ROS的變化趨勢相當， 40 mJ/cm2UVB照射后4 h，與陰性對照組之間差別有顯著性差別[(11.61±0.68) vs (8.25±1.21) nmoL/mg·prot，P=0.004 )]，照射后12 h，MDA有所下降[(9.95±1.17)nmoL/mg·prot]，但仍較陰性對照組高；無論是照射后4 h還是12 h，經(jīng)過LA干預(yù)后MDA值均得到下降，以40 mJ照射后LA孵育4 h后MDA下降更為明顯(P=0.019)。見圖4，表1。

2.4 TAOC檢測結(jié)果 根據(jù)標準曲線和測得的A值計算出各組TAOC濃度，單因素方差分析，F(xiàn)=0.518，LSD檢驗兩兩比較均P>0.05，各組之間均無統(tǒng)計學差異。見表1，圖5。提示各組總抗氧化能力無顯著差異。

MDA單因素方差分析F=4.695，對照組和H2O2之間、對照組和40 mJ/cm2UVB照射后4 h之間差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)，40 mJ/cm2UVB照射后4 h與12 h之間P=0.031，照射后4 h、12 h后加LA與未加LA 孵育兩組間均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組兩兩之間均顯著無統(tǒng)計意義。TAOC統(tǒng)計分析各組之間均無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 UVB照射或者H2O2孵育后細胞的形態(tài)變化 a：原代角質(zhì)形成細胞；b,c:40 mJ/cm2UVB照射原代角質(zhì)形成細胞后4、12 h后部分貼壁的細胞部分失去正常的膜結(jié)構(gòu)，折光度變差；d：原代角質(zhì)形成細胞；e,f:10 mmol/L H2O2溶液作用4 h后細胞間隙增寬、死亡的細胞增多，作用到12 h細胞密度又恢復(fù)正常，但細胞輪廓欠清，有較多漂浮死亡的細胞

圖2 DCF-DA染色效果圖 a、b、c圖依次為對照組、UVB照射組、UVB照射+LA治療組，可見后兩組綠色熒光強度較對照組明顯增強，提示ROS產(chǎn)生增多，c組熒光較b組有所減弱

圖3 UVB照射后4、12 h原代角質(zhì)形成細胞DCFH-DA染色顯示ROS熒光強度的對比圖4 UVB照射后4、12 h，LA孵育4、12 h原代角質(zhì)形成細胞MDA濃度對比圖5 UVB照射后4、12 h，LA孵育4、12 h原代角質(zhì)形成細胞總抗氧化能力，各組之間均無統(tǒng)計學差異

表1 原代角質(zhì)形成細胞DCFH-DA染色后DCF熒光強度、化學法檢測MDA和TAOC濃度

注：n=3。流式細胞儀檢測原代角質(zhì)形成細胞DCFH-DA染色后DCF熒光強度，單因素方差分析，F(xiàn)=13.352，陽性對照組、照射后4 h組ROS強度與陰性對照組均有顯著差異(P<0.001)，照射后12 h組較4 h組ROS下降有顯著差異(P=0.006)；照射后加抗氧化劑LA孵育4 h ROS下降較未加抗氧化劑組有統(tǒng)計學意義(P=0.002)

3 討論

正常的皮膚細胞由于新陳代謝產(chǎn)生少量的O2-、H2O2，UVA和UVB照射后通過直接作用和間接作用產(chǎn)生大量的ROS，包括超氧陰離子、單線態(tài)氧、過氧化氫和羥自由基。細胞內(nèi)存在固有的抗氧化防御系統(tǒng)，有清除ROS的作用，包括超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶等酶類；以及谷胱甘肽(GSH)、尿酸、輔酶Q和泛醌等活性物質(zhì)[3]。如果ROS不能被抗氧化系統(tǒng)及時拮抗，則會通過循環(huán)系統(tǒng)至其他組織和細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而誘導DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物和嘧啶二聚體等的產(chǎn)生，引起ERK1/2、p38 MAPK、JNK和NF-kappaB等信號通路的異常激活[5]，這些異常激活的信號通路將造成對組織分化增殖和損傷炎癥過程的異常調(diào)控，參與UVB介導的凋亡、光誘導腫瘤、光敏感性皮膚病和光老化的發(fā)生。要降低自由基對人體的危害，除了依靠體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)外還要尋找和發(fā)掘外源性自由基清除劑。

臨床常用的抗氧化劑如維生素C為水溶性，抑制細胞釋放氧自由基，清除細胞周圍氧自由基、提高過氧化氫酶谷胱甘肽還原酶活性，主要在生物水溶性腔隙中發(fā)揮較強的抗氧化作用；維生素E為脂溶性，主要保護細胞膜受到脂質(zhì)過氧化損傷，需要在其他抗氧化劑如維生素C的協(xié)同下再循環(huán)利用[2]。而LA同時具有脂溶性和水溶性，是線粒體a-酮酸氧化脫氫酶的一個輔助因子，LA能夠還原內(nèi)源性抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽，螯合鐵、銅和其他金屬，與這些金屬離子穩(wěn)定結(jié)合，抑制這些金屬催化的脂質(zhì)過氧化。LA的還原態(tài)二硫辛酸(DHLA)通過清除體內(nèi)的氧自由基和動員機體內(nèi)源性的抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽的生成發(fā)揮抗氧化作用[6,7]，作為新一代的抗氧化劑LA和DHLA一起被譽為“萬能抗氧化劑”，有廣泛的應(yīng)用前景。近年來有數(shù)個小規(guī)模的臨床研究報道局部外用5%的LA制劑有效改善面部的光老化現(xiàn)象，包括皮膚粗糙、細紋、暗沉，并抑制UV導致的皮膚曬傷，減少角質(zhì)形成細胞凋亡[8,9]。但在皮膚角質(zhì)形成細胞LA抗氧化應(yīng)激的的機理研究仍非常少。

本研究設(shè)置了外源性H2O2孵育組作為陽性對照組，運用UVB照射誘導角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激壓力，從氧化損傷水平和抗氧化水平檢測了細胞內(nèi)氧化-抗氧化體系，結(jié)果證實40 mJ/cm2UVB能誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，相當于10 mmol/L H2O2的氧化效果。流式細胞儀技術(shù)將染色后激發(fā)的綠色熒光準確定量，表明40 mJ/cm2的UVB照射后4 h細胞內(nèi)的ROS 水平較陰性對照組升高約30%～40%，與既往研究結(jié)果相一致[10]，隨著時間的推移ROS有自行下降的趨勢。照射后經(jīng)過抗氧化劑LA的處理，ROS下降的更為迅速。(見圖2和表1)。MDA是細胞膜脂質(zhì)被活性氧氧化的產(chǎn)物，是評價氧化應(yīng)激損傷程度的重要標志物，過度累計可直接反應(yīng)受氧化應(yīng)激損傷的程度。本研究結(jié)果顯示MDA的變化趨勢與ROS一致，抗氧化劑LA干預(yù)后MDA下降的更為顯著，體現(xiàn)了UVB誘導的急性光損傷以及LA的抗氧化應(yīng)激以及對抗光氧化損傷效應(yīng)。研究時發(fā)現(xiàn)，LA與正常的角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)4 h、12 h，ROS和MDA含量較陰性對照組并沒有發(fā)生明顯變化(數(shù)據(jù)未列出)，可能LA沒有改變內(nèi)環(huán)境正常細胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，在氧化壓力增高時才發(fā)揮抗氧化作用。

在抗氧化體系檢測方面，結(jié)果顯示UVB照射后各組細胞的總抗氧化能力均未發(fā)生顯著變化(見圖5和表1)。分析原因，可能是角質(zhì)形成細胞抗氧化酶整體水平表達低下，難以出現(xiàn)統(tǒng)計學上的差異，提示我們今后需要進一步的研究，更準確的對抗氧化系統(tǒng)進行定量。

綜上所述，本部分研究證實了UVB照射能夠引起原代角質(zhì)形成細胞氧化應(yīng)激損傷，與10 mmol/L的過氧化氫誘導的氧化應(yīng)激的陽性對照結(jié)果一致，LA通過降低ROS和MDA含量能夠有效的減輕UVB照射引起的氧化應(yīng)激損傷。實際上LA作為一種天然抗氧化劑，其廣譜抗氧化能力能夠?qū)苟喾N氧化損傷帶來的病理生理損傷，值得深入研究。