宋春草 梅 莉 蔡 麗 張 帥 樊孝萍

(1.樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；4.湖北省林科院石首楊樹研究所，湖北 荊州 434400)

楊樹 (Populus) 是我國分布最廣、面積最大的造林樹種，在我國木材供應(yīng)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中發(fā)揮重要作用。濕心材病是一種發(fā)病率高、危害大、防治難的枝干病害，在全世界范圍內(nèi)的多個樹種上普遍發(fā)生，在楊樹中發(fā)生尤為嚴(yán)重。2014年湖北省楊樹濕心材調(diào)查結(jié)果顯示，湖北省楊樹濕心材平均發(fā)病達(dá)到了89.7%，且發(fā)生嚴(yán)重的林分平均濕心材面積比例達(dá)到了0.399[1]。楊樹濕心材病變組織理化性質(zhì)發(fā)生改變，對木材干燥、加工及利用造成嚴(yán)重不利的影響，已經(jīng)成為限制我國楊樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大難題[2]。

濕心材病主要是由微生物活動導(dǎo)致的，并一定程度上受林地環(huán)境條件的影響[3-4]。晁龍軍等[5]從20多種楊樹中分離出的層出鐮刀菌 (Fusariumproliferatum) 能導(dǎo)致楊樹植株出現(xiàn)典型濕心材癥狀；趙桂華等[6]從楊樹濕心材組織中分離出了磚紅鐮刀菌 (F.lateritium) 和接骨木鐮刀菌 (F.sambucinum)，經(jīng)田間接種實驗證明其具有很強的致病性。因此，導(dǎo)致楊樹濕心材病的致病菌可能是多樣的，主要致病菌仍需要進一步分離鑒定。以往采用形態(tài)和生理生化方法鑒定楊樹濕心材致病菌存在一定的局限性，結(jié)合分子生物學(xué)方法通過對細(xì)菌DNA的同源性、基因的遺傳距離、系統(tǒng)進化等分析可以直接揭示不同細(xì)菌間的遺傳進化關(guān)系，在鑒定菌種上更具客觀性和可靠性優(yōu)勢[7-8]。宋春草等[9]結(jié)合形態(tài)、生理和分子生物學(xué)手段鑒定出一種胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種 (Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum) 具有導(dǎo)致濕心材的明顯致病性，并對該菌侵染楊樹的主要途徑進行了初步研究。

楊樹濕心材病的防治尚無有效方法，是當(dāng)前亟待解決的問題。鄭華英等[10]曾嘗試用林間化學(xué)殺菌劑防治楊樹濕心材病，發(fā)現(xiàn)防治實驗效果甚差。由于濕心材發(fā)病位置在樹干內(nèi)部，一般化學(xué)防治難以直達(dá)病理部位，而且化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用，會造成環(huán)境污染及病菌的抗藥性增強問題。而內(nèi)生拮抗菌在一些植物病害生物防治方面已有大量成功實例[11]，楊樹中也有相關(guān)成功的案例[12]，但目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于楊樹濕心材病的內(nèi)生拮抗菌的研究。因此，從楊樹體內(nèi)分離篩選有益拮抗菌，對于楊樹濕心材病及其他楊樹枝干病害的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用楊樹濕心材采自湖北省石首市楊樹研究所 (東經(jīng)112°25′，北緯29°40′)，以我國華中地區(qū)主栽楊樹品種為病理組織采集對象，包括華石1號、I-69、I-63、I-72、南林895號、中潛3號、中石7號。標(biāo)準(zhǔn)菌株BrenneriasalicisLMG 2698T (BS)， 標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)aenibacillustaiwanensisBCRC 17411T (PT)。

1.2 實驗方法

1.2.1致病菌篩選與致病性驗證

用火燒消毒處理的生長錐于樹木胸高處鉆取木芯樣品，每個品種取3棵樹的心材，取病健交接處木質(zhì)部組織，使用常規(guī)的組織分離法進行病原菌的分離，剪碎并加入滅菌生理鹽水充分振蕩搖勻獲得菌液，30 min后劃線接種于哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上分離純化,36 ℃培養(yǎng)12 h。篩選出10個優(yōu)勢菌株，溫室栽培的當(dāng)年生中石7號楊樹實生苗為病菌回接對象。于7月底分別接種10個菌株，接種時苗高1 m左右，地徑0.5 cm左右。

凍存菌株用LB液體培養(yǎng)基活化，36 ℃培養(yǎng)24 h，制備1 × 108CFU/mL菌懸液。用無菌注射器吸取菌液1 mL在距地表20 cm處莖段注入接種，深度為以傷及木質(zhì)部為準(zhǔn)，CK則用無菌培養(yǎng)基接種，各處理品種每株苗莖同時注射5次，每個處理品種重復(fù)接種10株苗。注射前在預(yù)注射部位用75%酒精消毒，注射后用脫脂棉浸透菌液包裹在傷口處，再用封口膜固定以防止水分散失。2個月后對接種材料進行截干，距離接種點上下15 cm處截斷苗莖，取明顯發(fā)病的莖段，用組織分離法對發(fā)病組織進行病原菌再分離，對比觀察兩次分離所得菌株的形態(tài)特征，提取再分離菌株與接種菌株的DNA，PCR擴增16SrRNA序列進行測序比對，同源性比對相同則表明接種成功。

1.2.2拮抗菌篩選方法

從發(fā)病輕微的楊樹心材中分離拮抗細(xì)菌，分離方法與致病菌分離方法一致，共篩選出18個優(yōu)勢菌株。采用對峙培養(yǎng)法初篩 (菌液)，具體是將致病菌和分離到的內(nèi)生菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，36 ℃ 160 r/min搖床培養(yǎng)14 h。然后取100 μL病原菌液均勻涂布于NA平板，靜置數(shù)分鐘，然后將直徑1 cm的無菌濾紙片分別浸入各供試細(xì)菌菌液中，再將濾紙片貼在平板的相應(yīng)區(qū)域 (以浸濕LB液體培養(yǎng)基的濾紙片為CK)，每種菌3次重復(fù)，平板置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察記錄抑菌圈的有無及大小。

濾液復(fù)篩：使用發(fā)酵法，將初篩菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，36 ℃ 160 r/min搖床培養(yǎng)3 d，用0.22 mm細(xì)菌過濾器過濾供試細(xì)菌培養(yǎng)液，然后取100 μL病原菌液涂布NA平板，靜置數(shù)分鐘，然后將直徑1 cm的無菌濾紙片分別浸入各供試細(xì)菌菌液中，再將濾紙片貼在平板的相應(yīng)區(qū)域 (以浸濕LB 液體培養(yǎng)基的濾紙片為CK)，每種菌3次重復(fù)，平板置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察記錄抑菌圈的有無及大小。觀察是否有拮抗圈產(chǎn)生以及拮抗圈大小。

接種復(fù)篩：將篩選到的拮抗菌和病原菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，36 ℃ 160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，制備1 × 108CFU/mL菌懸液。選擇生長一致的1年生楊樹實生苗，用無菌注射器吸取1 mL菌液在距地表20 cm處莖段注入菌液接種，深度為以傷及木質(zhì)部為準(zhǔn)，共設(shè)置4個處理：T1，先接種拮抗菌，24 h后再接種病原菌；T2，只接種拮抗菌；T3，只接種培養(yǎng)基，作為陰性對照；T4，只接種病原菌，作為陽性對照。每處理3個重復(fù)，將處理好的楊樹放置于防蟲溫室內(nèi)培養(yǎng)。接種50 d后對處理材料截干。將截干枝條帶回室內(nèi)，在位于接種點上下高10～15 cm處截斷，然后自中央髓心出縱向剖開，調(diào)查接種點上下髓心部及邊材產(chǎn)生濕心材癥狀的長和寬，記錄各處理濕心材發(fā)病情況 (表1)，按公式 (1)～(2) 計算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=100 × ∑ (各級病株數(shù) × 各級代表值)/(調(diào)查總株數(shù) × 最高級代表值)

(1)

相對防治效果 (%)=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)] × 100%

(2)

表1 楊樹濕心材病心材癥狀等級Table 1 Symptom grade of heartwood from Populus with wet-heartwood disease

注：癥狀以心材變色長度為標(biāo)準(zhǔn) (變色心材長度范圍為1.7～15.4 cm)。

1.3 致病菌和拮抗菌的鑒定

1.3.1形態(tài)鑒定

無菌條件下，在直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，用PDA培養(yǎng)基對致病菌和拮抗菌進行劃線培養(yǎng)，觀察菌落的形狀、邊緣特征、表面是否光滑、凸起形狀、透明度、色素產(chǎn)生情況等。利用負(fù)染法染色，透射電鏡觀察菌體形狀、有無芽胞、芽孢數(shù)量和著生位置以及鞭毛特征 。

1.3.2生理生化鑒定

將BS作為對照菌株，參照任欣正[13]的方法分類和鑒定植物病原菌。

1.3.3全細(xì)胞脂肪酸分析

將致病菌株和BS于TSBA固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)24 h后，收集菌體。脂肪酸分析由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室完成。使用Sherolock全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng) (MIDI公司,美國)。

皂化反應(yīng)：加入1 mL溶液1 (45 g氫氧化鈉溶于150 mL甲醇及150 mL蒸餾水)，沸水浴30 min，殺滅細(xì)菌并使細(xì)胞裂解，從而使菌體中的脂肪酸游離；甲基化：加入2 mL溶液2 (190 mL濃鹽酸、275 mL甲醇溶于135 mL蒸餾水)，80 ℃水浴10 min，使游離的脂肪酸變?yōu)閾]發(fā)性的脂肪酸；萃?。杭尤?.25 mL溶液3 (正己烷與甲基叔丁基醚的等體積混合液) 萃取脂肪酸甲酯；堿洗滌：加入3 mL溶液4 (10.8 g氫氧化鈉溶于900 mL蒸餾水) 及數(shù)滴溶液5 (飽和氯化鈉溶液)，快速振蕩5 min，取上層有機相置氣相色譜樣品專用瓶中備用。

1.3.4致病細(xì)菌分子鑒定

細(xì)菌DNA的提取：將待測細(xì)菌接于LB液體培養(yǎng)基中活化，36 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，取1.5 mL菌液于2 mL離心管中離心得菌體，加無菌水再次離心，棄去上清液，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒 (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,中國) 提取DNA。

16SrRNA擴增與測序：16SrRNA序列擴增采用細(xì)菌通用引物8F/1525R。

8F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′,

1525R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′ (上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成)。

PCR反應(yīng)體系：LAmp PCR Buffer (10×) 5 μL，NTP (2.5 mmol/L) 4 μL,8F (10 μmol/L) 2 μL,1525R (10 μmol/L) 2 μL，TaqDNA (5 U/μL) 1 μL，DNA 2 μL，C-Solution3 (5×) 10 μL，ddH2O 24 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠對反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳檢測。PCR產(chǎn)物測序由上海桑尼生物科技有限公司完成。測得菌株的序列輸入EzBioCloud網(wǎng)站 (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) 的EzTaxon中，比較菌株12-1與其他已知細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA序列同源性，選取與測序菌株序列同源性高的菌株，在MEGA5.0中進行比對，用最大自然法ML構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

多基因序列分析 (MLSA) 研究選用gyrB、rpoB、atpD和infB這4個基因。PCR擴增引物參照李永[14]的方法，引物由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：10 × PCR buffer 5.0 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 4.0 μL，F(xiàn) (10 pmol/L) 2.0 μL，R (10 pmol/L) 2.0 μL，Taq酶 (2.5 U) 1.0 μL，DNA (5～100 ng/μL) 2.0 μL，無菌超純水34 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35次循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物的電泳檢測方法同16SrRNA序列檢測法。從GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 下載與12-1菌株相關(guān)的已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrB,rpoB,infB和atpD序列。使用Mega 5.0軟件將這4個看家基因進行手工拼接組成一個大的完整的片段，順序依次是gyrB、rpoB、infB和atpD。然后利用Mega 5.0對拼接好的的基因片段進行比對，用最大自然法ML構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌的分離及致病性

通過平板分離法分離純化得到10個菌株 (表2)，皆為桿狀或棒狀，除3～6號菌株外，其余9個菌株皆為革蘭氏陰性菌。

表2 楊樹中分離出的10個細(xì)菌菌株形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of 10 bacterium strains separated from Populus

將分離純化的10個菌株分別回接到健康的1年生實生苗。結(jié)果表明：12-1能在楊樹上引起典型的心材變色腐爛現(xiàn)象，病癥從接種處分別向莖上下擴散，向上擴散較迅速，病斑縱向擴展較橫向擴展明顯，接種點邊緣的樹皮明顯腐爛下陷 (圖1a)，CK則只有刺傷處傷口愈合痕跡，沒有腐爛現(xiàn)象 (圖1b)。

圖112-1菌株回接楊樹實生苗致病現(xiàn)象
Fig.1 Symptoms of wet-heart wood caused by 12-1 pathogen strain inPopulusseedlings

對接種后發(fā)病的楊樹苗莖干進行病原菌再分離，均分離到與接種菌菌落形態(tài)一致，且16SrRNA基因序列一致的菌株，表明該菌是導(dǎo)致楊樹濕心材的致病菌之一。

2.2 致病菌鑒定

2.2.1致病菌形態(tài)

在PDA培養(yǎng)基上，12-1菌落呈乳白色，邊緣光滑、凸起、不透明、不產(chǎn)生色素 (圖2a)；革蘭氏染色為紅色、陰性，菌體呈短桿狀 (圖2b)。電鏡下12-1菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小0.5～1 μm × 1～3 μm；周生鞭毛，無芽孢 (圖2c)。

2.2.2致病菌生理生化特征

12-1菌株為革蘭氏陰性菌，氧化酶和硝酸鹽還原為陰性，葡萄糖氧化發(fā)酵，37 ℃不能生長 (表3)。表明12-1菌株各項生理生化特征和BS基本一致。

圖212-1菌株形態(tài)鞭毛特征
Fig.2 Morphology and flagellation characteristics of 12-1 bacteria strain

表3 12-1和BS生理生化特征比較Table 3 Phenotypic characteristics between 12-1 and BS

注：+．陽性; -．陰性; /.不穩(wěn)定。

2.2.3全細(xì)胞脂肪酸特征

致病菌株12-1主要脂肪酸為C14:0，C16:0，C17:0，iso-C16:1/C14:03-OH和 C16:1ω7c/iso-C15:02-OH。12-1菌株的脂肪酸種類和BS的脂肪酸種類基本相同，脂肪酸豐度較高的種類一致性更明顯，如脂肪酸C12:0，C16:0，這2種脂肪酸的豐度都與BS的脂肪酸豐度一致 (表4)。

2.2.4致病細(xì)菌分子鑒定

16SrRNA基因序列分析， 12-1菌株基因片斷長度為1 414 bp (GenBank登陸序列號KR401279)。

經(jīng)16SrRNA序列同源性對比，結(jié)果顯示12-1菌株和Brenneria屬的BS同源性最高，達(dá)到99.18%，與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性低于97%。

表4 菌株12-1與BS的脂肪酸特征Table 4 Fatty acid composition characteristics between 12-1 and BS

于NCBI下載與12-1菌株近緣種標(biāo)準(zhǔn)菌的16SrRNA序列，以標(biāo)準(zhǔn)菌株CronobactersakazakiiATCC 29544 T為樹根，用軟件MEGA 5.0構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育進化樹，序列大小為1 500 bp左右，1 000次驗證，自展值大于50%顯示。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果可以看出，基于16SrRNA基因序列構(gòu)建的ML進化樹中，該菌種與BS聚成單獨的進化枝 (自展值為99%) (圖3)。

圖3最大自然法構(gòu)建的基于16SrRNA基因序列的12-1菌株系統(tǒng)進化樹(自展值>50%顯示)
Fig.3 Phylogenetic tree by the maximum likelihood method based on 16SrRNA gene sequences,showing the relationship of strain 12-1 and related species.Bootstrap values(> 50%)are shown at nodes

MSLA 分析，于NCBI下與12-1菌株親緣關(guān)系近的標(biāo)準(zhǔn)菌株的gyrB、rpoB、atpD和infB基因序列，按順序拼接，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ErwiniaamylovoraLMG 2024T為樹根，用軟件MEGA5.0構(gòu)建基于MLSA序列ML系統(tǒng)進化樹，在進化樹中，本研究的菌種12-1與BS聚成單獨的進化枝(自展值均為100%，圖4)。MSLA分析結(jié)果與16SrRNA基因序列構(gòu)建的ML樹主要分支基本一致。

圖4最大自然法構(gòu)建的gyrB、rpoB、atpD和infB基因序列的12-1菌株系統(tǒng)進化樹(自展值>50%顯示)
Fig.4 Phylogenetic tree by the maximum likelihood method based on concatenated partialgyrB,rpoB,atpDandinfBgene sequences,showing the relationship of strain 12-1 and related species.Bootstrap values (> 50%) are shown at nodes

2.3 拮抗菌篩選結(jié)果

從濕心材發(fā)病程度輕微的楊樹中共分離得到18株菌株，利用平板對峙法初篩得到對楊樹濕心材病原細(xì)菌有抑制作用的菌株3株，依次編號為J-4，J-5，J-6 (圖5,表5)。用待測細(xì)菌濾液經(jīng)平板對峙法進行篩選，結(jié)果濾液對病原細(xì)菌均無拮抗作用。將3種拮抗菌分別接種楊樹實生苗，發(fā)現(xiàn)T4有最嚴(yán)重濕心材癥狀 (圖6)。只接種拮抗菌和只接種培養(yǎng)基的楊樹只在接種點傷口愈合處有輕微變色，但接種拮抗菌的楊樹苗 (J-4、J-5) 發(fā)病程度顯著比只接病原菌的低，其中接種J-4的發(fā)病程度最輕 (圖5)。

圖5拮抗菌對12-1的抑菌效果
Fig.5 Antibacterial effect of antagonistic bacteria on 12-1

表5 拮抗菌對12-1的抑菌圈直徑Table 5 The inhibition zone diameter of antagonistic antibacterial against 12-1

注：表中所列抑菌圈的直徑為3個重復(fù)的平均值。

以病情指數(shù)和相對防治效果來衡量拮抗菌田間拮抗效果 (表6)。從篩選結(jié)果來看，菌株J-4在實生苗上對12-1致病菌具有較強的抑制作用，其防治效果達(dá)72.7%；菌株J-5的防治效果只有31.8%；而菌株J-6在實生苗上對12-1沒有明顯防治效果 (圖6)。

表6 拮抗菌對12-1的防治結(jié)果Table 6 Control effect of antagonistic bacteria on 12-1

從左到右依次：1.先接種J-5，24 h后接種病原菌12-1的莖段；2.先接種J-6，24 h后再接種病原菌12-1的莖段；3.先接種J-4，24 h后再接種病原菌12-1的莖段；4.僅接種病原菌12-1的莖段。

圖6拮抗菌接種對12-1病菌的防治結(jié)果
Fig.6 Effect of antagonistic to 12-1 bacteria on seedlings

2.4 拮抗菌J-4的鑒定

2.4.1形態(tài)特征

拮抗菌株J-4在NA培養(yǎng)基上菌落表面平滑濕潤、邊緣波狀，呈灰白色。菌體桿狀，可以產(chǎn)芽孢，周生鞭毛，革蘭氏染色陰性，屬于兼性厭氧菌 (圖7)。菌株J-4為革蘭氏陰性菌，接觸酶反應(yīng)為陽性，氧化酶反應(yīng)為陰性，可以在pH 4.5的NA培養(yǎng)基上生長，可以分解淀粉，不產(chǎn)生吲哚。各項生理生化特征和PT生理生化特征一致。

2.4.2生理生化特征

菌株J-4為革蘭氏陰性菌，接觸酶反應(yīng)為陽性，氧化酶反應(yīng)為陰性，可以在pH 4.5的NA培養(yǎng)基上生長，可以分解淀粉，不產(chǎn)生吲哚。各項生理生化特征和PT基本一致。其他生理生化特征見表7。

圖7 J-4拮抗菌形態(tài)鞭毛特征Fig.7 Morphology and flagellation characteristics of J-4 strain

項目結(jié)果J-4結(jié)果PT項目結(jié)果J-4結(jié)果PT接觸酶反應(yīng)++水楊苷++氧化酶反應(yīng)--D-纖維二糖++pH 4.5生長4.5++D-蜜二糖--淀粉水解++蔗糖++吲哚產(chǎn)生--D-海藻糖++甘油++D-松三糖++核糖醇--D-棉子糖--D-半乳糖--淀粉--D-甘露糖--肝糖--肌醇--葡糖酸鹽++苯丙氨酸脫氨酶--脲酶--苦杏仁苷++產(chǎn)生H2S --熊果苷--

注：+表示陽性；-表示陰性。

2.4.316SrRNA基因序列

通過引物PF和PR，以J-4細(xì)菌基因組DNA為模板進行PCR，獲得大約為1.5 kb的特異性片段。序列測定結(jié)果表明，片斷長度為1 423 bp，其序列見GenBank登陸序列號KR492891。

通過EzBioCloud網(wǎng)站 (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) 的EzTaxon-e序列比較，比較菌株J-4與其他已知細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA序列同源性，結(jié)果顯示J-4和Paenibacillus屬的PT同源性最高，達(dá)到99.37%，與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性低于97%。

從NCBI上下載與J-4近緣種標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA序列，用軟件MEGA 5.0構(gòu)建基于這些序列的NJ和ML系統(tǒng)進化樹，序列大小為1 500 bp左右，所打節(jié)點通過1 000次不同取樣進行了驗證，以標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).kobensisNBRC 15729T為樹根。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)樹的結(jié)果來看，基于16SrRNA基因序列構(gòu)建的NJ和J4ML樹的主要分支枝基本一致。在這2個進化樹中，本研究的菌種J-4與PT聚成單獨的進化枝(自展值均為100%，圖8～9)。

1 000次自舉檢驗，自展值50%以上顯示。除本研究的序列外，其他菌株的基因序列均來自GenBank。

圖8相鄰法構(gòu)建的基于16SrRNA基因序列的J-4系統(tǒng)進化樹
Fig.8 Neighbor-Joining method tree based on 16SrRNA gene sequences,showing the relationship of strain J-4 and related species

1 000次自舉檢驗，自展值50%以上顯示。除本研究的序列外，其他菌株的基因序列均來自于GenBank。

圖9最大自然法構(gòu)建的基于16SrRNA基因序列的J-4系統(tǒng)進化樹
Fig.9 Maximum likelihood method tree based on 16SrRNA gene sequences,showing the relationship of strain J-4 and related species

3 結(jié)論與討論

將從楊樹濕心材組織分離出的10株優(yōu)勢菌株回接實生苗，結(jié)果表明12-1菌株具有強致病性，被侵染植株出現(xiàn)典型濕心材癥狀。綜合形態(tài)特征，生理生化指標(biāo)分析，全細(xì)胞脂肪酸分析，16SrRNA序列分析以及多基因序列分析的方法，鑒定12-1致病菌為楊柳歐文氏桿菌，與鄭華英等[10]研究中分離出的細(xì)菌同屬一個種。研究發(fā)現(xiàn)，楊柳歐文氏桿菌在柳樹體內(nèi)達(dá)到一定濃度時可引發(fā)柳樹水痕病病害，也有該病菌可以侵染柳樹 (Salix)、楊樹以及榿木 (Alnuscremastogyne) 等多種樹木引發(fā)病害的報道[15-16]。李永[14]在歐美楊 (Populus×canadensis) 內(nèi)分離到優(yōu)勢菌株楊柳歐文氏桿菌 (Brenneriasalicis)，遲淼[17]在分離楊樹內(nèi)生菌時也分離到楊柳歐文氏桿菌，但并沒有進一步研究該菌的致病性，也未對該細(xì)菌進行系統(tǒng)的分子鑒定。本研究觀察到的楊樹發(fā)病情況及發(fā)病規(guī)律與其他研究中楊柳歐文氏桿菌引發(fā)病害的規(guī)律基本一致。病細(xì)菌的系統(tǒng)鑒定結(jié)果為該病害的有效防控奠定了基礎(chǔ)。關(guān)于導(dǎo)致楊樹濕心材的該病菌以何種途徑傳播，病原菌致病機理以及病原菌與楊樹植株間的互作機理尚有待進一步研究。

從植物體內(nèi)篩選的拮抗菌株，在植物體內(nèi)具有很好的定殖能力，是植病生物防治的一類極具應(yīng)用潛能的新資源微生物。內(nèi)生拮抗細(xì)菌在一些植物病害生物防治方面已有大量成功實例，如在香蕉 (Musanana) 內(nèi)葉面噴灑熒光假單胞菌 (Pseudomonasfluorescens) 和枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis) 株混合制劑，不僅能夠降低香蕉束頂病的發(fā)病率，也能提高植株生長速率[18]。Brooks等[19]通過室內(nèi)接種從橡樹 (Heveabrasiliensis) 中分離到的內(nèi)生細(xì)菌脫氮桿菌 (Bacillusdenitrificans)，大大降低了櫟枯萎病發(fā)病率。利用植物內(nèi)生細(xì)菌也是林木防病治病切實可行的方法，國內(nèi)外學(xué)者對楊樹內(nèi)生細(xì)菌也開展了部分研究，胥麗娜[20]從楊樹組織塊中分離得到37株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)篩選得到幾株對楊樹水泡潰瘍病菌具有較好拮抗作用的拮抗菌。國外學(xué)者在分離楊樹內(nèi)生菌時也獲得了一些內(nèi)生細(xì)菌菌株，發(fā)現(xiàn)一些菌株可以固定碳源和促進植物新陳代謝[21-22]，但目前尚沒有涉及利用楊樹內(nèi)生細(xì)菌防治楊樹濕心材病的研究。在楊樹中篩選出對濕心材致病菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，不僅對楊樹濕心材病的研究和防治有著直接的意義，也將對其他樹種以及其他植物病害的防治有重要的指導(dǎo)意義。

本研究從楊樹濕心材組織分離并純化出致病菌楊柳歐文氏桿菌，為該病害的有效防控奠定了基礎(chǔ)。同時，從楊樹心材中分離的菌株J-4表現(xiàn)出對楊樹濕心材具有較強的抑制作用，防治效果高達(dá)72.7%。經(jīng)生理生化鑒定和16SrRNA序列分析，初步確定這株對楊樹濕心材病原菌菌拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌為類芽孢桿菌，這是首次報道該菌對濕心材病原菌具有拮抗作用，這對于生防菌在楊樹濕心材生物防治中的實際應(yīng)用具有重要意義。