基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)研究揭示年齡對(duì)屏障功能恢復(fù)的影響：年長(zhǎng)志愿者的表皮修復(fù)過(guò)程會(huì)延遲發(fā)生

皺紋、皮膚下垂以及色斑等是皮膚老化過(guò)程中常見(jiàn)的外觀改變，同時(shí)還可能伴隨一些不適感，例如對(duì)刺激物敏感性增強(qiáng)或重度干燥癥增多等，這些不適感的出現(xiàn)可能跟表皮屏障的滲透性和表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化有關(guān)。實(shí)際上，不同年齡人群的角質(zhì)層厚度都在正常范圍且屏障功能也差異甚微，但年長(zhǎng)者皮膚出現(xiàn)慢性干燥癥的概率卻較高，同時(shí)其經(jīng)表皮失水量（TEWL）也會(huì)增大。這可能與老化角質(zhì)層內(nèi)細(xì)胞間脂質(zhì)成分的改變和總脂質(zhì)量的減少有關(guān)，因?yàn)榻琴|(zhì)層組分的變化會(huì)直接影響屏障功能的物理化學(xué)特性。

到目前為止，大多數(shù)報(bào)道的臨床研究都基于TEWL測(cè)量來(lái)分析表皮屏障功能或檢測(cè)受損后表皮恢復(fù)到正常的內(nèi)穩(wěn)態(tài)情況。但TEWL僅能為屏障恢復(fù)動(dòng)力學(xué)提供一個(gè)宏觀的視圖，無(wú)法從微觀的分子水平來(lái)洞悉屏障恢復(fù)過(guò)程。因此我們?cè)赥EWL的基礎(chǔ)上，增加轉(zhuǎn)錄分析法來(lái)描述不同的皮膚生理?yè)p傷或美容處理對(duì)人表皮屏障功能的影響，還通過(guò)微陣列分析來(lái)按時(shí)間順序確定表皮恢復(fù)過(guò)程中所發(fā)生的主要分子變化，了解多種生物學(xué)功能。該研究旨在比較年長(zhǎng)和年輕志愿者在人為除去角質(zhì)層后表皮屏障功能恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的特征，希望能通過(guò)確定可重復(fù)的重要標(biāo)記物來(lái)反映年齡對(duì)屏障功能的影響。

一、材料和方法

研究招募30名（67±4）歲健康白種人男性志愿者作為年長(zhǎng)組，皮膚光反應(yīng)類型Ⅱ-Ⅲ型。年輕對(duì)照組來(lái)自之前一個(gè)相似的研究，由30名（27±4）歲的志愿者組成。使用膠帶剝脫法對(duì)這兩組志愿者一側(cè)前臂屈側(cè)皮膚連續(xù)貼撕，直至皮膚發(fā)光即完成角質(zhì)層移除。年長(zhǎng)組、年輕組分別需要（48±7）、（45±8）次操作來(lái)達(dá)到預(yù)期，每名志愿者對(duì)側(cè)前臂屈側(cè)皮膚作為對(duì)照。隨后對(duì)雙前臂皮膚進(jìn)行局部麻醉，分別獲得剝脫處和對(duì)側(cè)皮膚組織活檢標(biāo)本（1.5 cm×1.5 cm）。將兩組志愿者（各30人）再隨機(jī)分成5個(gè)亞組（每6人1組），每個(gè)亞組對(duì)應(yīng)1個(gè)取樣時(shí)間，分別在初次取樣后的2、6、18、30和72 h再次進(jìn)行雙臂取樣，記錄屏障恢復(fù)隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)。具體分析方法和數(shù)據(jù)處理請(qǐng)參考原文。

二、結(jié)果

1.屏障功能恢復(fù)動(dòng)力學(xué)：反復(fù)剝脫處理去除角質(zhì)層會(huì)引起即刻TEWL急劇增加。隨著時(shí)間推移，水分流失量會(huì)逐漸恢復(fù)正常。對(duì)比年長(zhǎng)和年輕兩組志愿者皮膚剝脫處理后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的屏障功能恢復(fù)率發(fā)現(xiàn)：在整個(gè)動(dòng)力學(xué)過(guò)程中，年輕組的恢復(fù)非常顯著（P=0.001 1），而年長(zhǎng)組前30 h的恢復(fù)都不明顯。雖然兩組在72 h的恢復(fù)情況相似，但年輕組的屏障恢復(fù)速度明顯快于年長(zhǎng)組。

2.年輕與年長(zhǎng)組表皮內(nèi)基因調(diào)控情況：膠帶剝脫操作后的一段時(shí)間內(nèi)，年長(zhǎng)組表皮細(xì)胞內(nèi)有382個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，年輕組則為370個(gè)。兩組中有184個(gè)基因都被調(diào)節(jié)，另外還有198個(gè)基因和186個(gè)基因分別在年長(zhǎng)和年輕組中發(fā)生調(diào)控。因此，兩組的特征差異主要來(lái)自這198和186個(gè)基因的調(diào)控情況。

3.年輕和年長(zhǎng)組表皮修復(fù)過(guò)程中基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄6名志愿者，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別會(huì)得到370個(gè)（年輕組）和382個(gè)（年長(zhǎng)組）受調(diào)基因的30個(gè)子集合。通過(guò)無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)的層次聚類法，對(duì)這些受調(diào)基因?qū)?yīng)的整個(gè)折疊變化值進(jìn)行收集和分類，目的是不帶任何前提地分析出數(shù)據(jù)。研究目的之一是跟蹤兩組志愿者基因表達(dá)情況隨時(shí)間的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同年齡組間基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)存在差異。年輕組在6 h和年長(zhǎng)組在30 h都清晰地出現(xiàn)了基因表達(dá)最強(qiáng)烈的變化。在年輕組表皮中，受調(diào)基因數(shù)量從2 h的52個(gè)急劇增加至6 h的266個(gè)，而18 h又逐漸減少到122個(gè)，30 h繼續(xù)降至104個(gè)，72 h降至8個(gè)。在年長(zhǎng)組表皮中，受調(diào)基因的數(shù)量是從2 h的32個(gè)增加至6 h的145個(gè)，再到18 h的112個(gè)，30 h增加至286個(gè)，而72 h降至27個(gè)。

4.受調(diào)基因的功能分析：年長(zhǎng)組和年輕組受調(diào)基因所致的分子功能無(wú)明顯差異，每個(gè)功能家族受調(diào)基因的數(shù)量也基本相同。主要的差別是參與屏障修復(fù)過(guò)程的每個(gè)生物學(xué)功能發(fā)生的時(shí)間，總體來(lái)看年長(zhǎng)組要晚于年輕組。參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖及參與DNA、RNA和蛋白加工家族的基因是兩個(gè)典型的例子。這些基因隨時(shí)間呈鐘型曲線變化，年輕組在6 h達(dá)到峰值，而年長(zhǎng)組則在30 h達(dá)到峰值。

5.年長(zhǎng)組和年輕組表皮受調(diào)基因的總體比較：在兩組中挑選出表達(dá)會(huì)隨時(shí)間變化的184個(gè)基因，通過(guò)雙向方差分析法來(lái)比較兩組基因，確定基因表達(dá)隨時(shí)間和年齡的顯著性改變，分析年齡對(duì)基因調(diào)控發(fā)生時(shí)間的影響。發(fā)現(xiàn)有8個(gè)基因的表達(dá)隨年齡或年齡/時(shí)間相互作用而分別呈顯著性差異?？赡苁且?yàn)椴煌挲g供體的基因受調(diào)強(qiáng)度有差異（如基因SPPR1B），也可能是基因受調(diào)控的動(dòng)力學(xué)不同（如基因KRT6B）。這8個(gè)基因主要都參與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。

此外，186個(gè)基因僅在年輕組內(nèi)發(fā)生調(diào)控，198個(gè)基因僅在年長(zhǎng)組內(nèi)發(fā)生調(diào)控。這兩組基因應(yīng)該能夠說(shuō)明在表皮修復(fù)過(guò)程中與年齡相關(guān)的特異性變化。接著又挑選了這些年齡特異性受調(diào)基因的核心群體，同時(shí)挑選6 h和30 h作為比較時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)檫@兩組大部分的基因是在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生調(diào)控。分析后發(fā)現(xiàn)這些基因即是在表皮修復(fù)過(guò)程中與年齡相關(guān)特異性最可靠也最具代表性的基因群體。年輕組受調(diào)基因主要參與DNA、RNA管理及蛋白質(zhì)加工，年長(zhǎng)組的受調(diào)基因則主要參與細(xì)胞通訊、解毒和氧化應(yīng)激的管理。

三、討論

之前，我們分析了年輕志愿者在角質(zhì)層移除后2～72 h內(nèi)表皮屏障功能隨時(shí)間的恢復(fù)情況。在該研究中我們追加了年長(zhǎng)志愿者的相關(guān)數(shù)據(jù)，并對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，以了解皮膚老化在表皮屏障功能恢復(fù)過(guò)程中的作用。首先，TEWL測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比年輕組，年長(zhǎng)組表皮屏障功能恢復(fù)相對(duì)延遲，即整個(gè)72 h內(nèi)，年輕組的TEWL動(dòng)力曲線變化十分明顯，而年長(zhǎng)組則是到30 h才出現(xiàn)顯著變化。分析兩組樣本不同時(shí)間點(diǎn)的受調(diào)基因情況進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。對(duì)于年輕組，基因受調(diào)率峰值出現(xiàn)在角質(zhì)層移除后6 h，而年長(zhǎng)組則推遲出現(xiàn)在30 h?？梢?jiàn)在年輕組表皮中，與修復(fù)過(guò)程相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)會(huì)更早發(fā)生。其次，還發(fā)現(xiàn)不同年齡段的受調(diào)基因差別巨大。兩組均有約400個(gè)基因發(fā)生調(diào)控，相似的基因僅為184個(gè)，另外還有198個(gè)（年長(zhǎng)組）和186個(gè)（年輕組）基因完全不同。盡管如此，這些基因總體的生物學(xué)功能還是比較相似。不同的是，年輕組中大部分基因的調(diào)控發(fā)生在角質(zhì)層移除后6 h，而年長(zhǎng)組則發(fā)生在30 h。同時(shí)一些與剝脫相關(guān)的分子功能在年長(zhǎng)表皮內(nèi)也會(huì)延遲發(fā)生，這些功能包括細(xì)胞黏附、氧化應(yīng)激管理、細(xì)胞基質(zhì)組成、介導(dǎo)胞內(nèi)和胞間信號(hào)的加工、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、DNA或RNA加工/合成及修復(fù)。最后，盡管參與兩組表皮屏障恢復(fù)的總體生物學(xué)功能在根本上是相似的，但仍有3組基因的表達(dá)表現(xiàn)出明確的年齡依賴性差異。該結(jié)果強(qiáng)烈提示，年長(zhǎng)組表皮延遲的屏障修復(fù)過(guò)程是由基因應(yīng)答的總體滯后所導(dǎo)致的。這些滯后應(yīng)答的基因包括細(xì)胞信號(hào)、DNA轉(zhuǎn)錄、RNA翻譯以及一些參與表皮分化過(guò)程中屏障修復(fù)的重要基因。例如年長(zhǎng)組表皮內(nèi)KRT6B基因調(diào)控明顯延遲。KRT6B基因會(huì)在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)受過(guò)度增殖刺激（如傷口愈合、銀屑病以及一些其他炎癥性疾病等）的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。年長(zhǎng)組該基因的延遲誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致老化的角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)剝脫性損傷出現(xiàn)延遲適應(yīng)。另外，SPPR1B基因（角質(zhì)蛋白）在年輕組表皮內(nèi)顯著上調(diào)，而在年長(zhǎng)組表皮內(nèi)則變化幅度較弱。此基因?qū)?yīng)編碼的角質(zhì)蛋白能夠在屏障受損的時(shí)候緊急提供表皮的骨架結(jié)構(gòu)，年長(zhǎng)表皮中該基因的低誘導(dǎo)可能反映了較差的表皮屏障恢復(fù)能力。研究還發(fā)現(xiàn)一些涉及線粒體電子傳遞機(jī)制的基因在兩組間的差異（年長(zhǎng)組中上調(diào)），表明老化的表皮修復(fù)需要更多能量。

綜上，我們?cè)诒狙芯恐忻鞔_了年輕和年長(zhǎng)者表皮修復(fù)的特異性轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，為描述表皮修復(fù)情況和內(nèi)穩(wěn)態(tài)提供了新方法。另外，相比TEWL檢測(cè)法，轉(zhuǎn)錄學(xué)分析對(duì)比較年齡對(duì)屏障功能的影響會(huì)更加敏感。然而該臨床研究還需要更多的皮膚活檢數(shù)據(jù)，但這會(huì)涉及到一些倫理問(wèn)題。無(wú)論如何，了解正常表皮和維持表皮完整的機(jī)制至關(guān)重要，有助于發(fā)現(xiàn)促進(jìn)表皮修復(fù)和改善表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的新對(duì)策。