BRCA1/2基因檢測在惡性腫瘤中的應(yīng)用

李萌輝 綜述 劉俊田 審校

DNA 損傷對基因組完整性造成重大威脅，若不能正確修復(fù)可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。同源重組是基因錯配修復(fù)的最主要的途徑之一，參與細胞同源重組修復(fù)有兩個重要基因-乳腺癌易感基因1（breast cancer gene 1，BRCA1）和乳腺癌易感基因2（breast cancer gene 2，BRCA2）。BRCA1/2 基因突變可以導(dǎo)致乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、皮膚癌以及前列腺癌等風(fēng)險顯著增加［1］。BRCA1/2 臨床檢測興起于20 世紀(jì)90年代中期，最初僅在美國的一個實驗室及澳大利亞和歐洲的少數(shù)實驗室開展。隨著專利到期和人們對基因檢測潛在益處認識的提高，接受BRCA1 和BRCA2基因檢測患者的數(shù)量和疾病譜發(fā)生了巨大變化。高通量測序技術(shù)（next-generation sequencing technology，NGST）一次性可以檢測更多的基因，結(jié)果更可靠、價格更低，大幅縮短了檢測所需時間，促使BRCA1/2 檢測廣泛應(yīng)用于臨床［2］。據(jù)乳腺癌信息中心（breast cancer informationcore，BIC）截至2017年12月數(shù)據(jù)顯示，約1 800 余個BRCA1 和2 000 多個BRCA2 基因突變位點，其中53%～55%是個體突變，僅在個別家族中發(fā)現(xiàn)。致病突變大多是小片段缺失、插入及非同義突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能缺陷［3］。另外，內(nèi)含子發(fā)生的變異亦可能通過干擾RNA 剪切等方式影響蛋白質(zhì)功能，尤其是靠近剪接位點附近的突變。但是，所檢測到的致病突變分布于整條基因序列，在不同地域及不同種族之間差異較大，很難確定固定的突變熱點。

BRCA1/2 基因檢測不僅局限于乳腺癌和卵巢癌的癌癥發(fā)病風(fēng)險測定，并且與癌癥的特殊類型如三陰性乳腺癌、臨床分期、疾病進展和預(yù)后具有相關(guān)性［4］。此外，BRCA1/2 突變對乳腺癌、卵巢癌患者含鉑類化療方案和聚ADP 核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑治療方案選擇起決策性作用。但是，隨著BRCA1/2基因檢測廣泛開展，也面臨著實驗技術(shù)本身、報告解讀、醫(yī)學(xué)倫理等多方面的挑戰(zhàn)。

1 BRCA1/2的基因結(jié)構(gòu)和功能

BRCA1 和BRCA2 定位于人類染色體17q21 和13q12，分別是在1990年和1994年被鑒定出來的。BRCA1含有23個外顯子，編碼的蛋白由1 863個氨基酸組成，BRCA2含有27個外顯子，編碼的蛋白由3 418個氨基酸組成。BRCA1/2共同參與同源重組修復(fù)，對維持基因的穩(wěn)定性和完整性至關(guān)重要，是重要的抑癌基因［3］。BRCA1/2參與多種細胞生物學(xué)過程，包括DNA 損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞周期調(diào)節(jié)等。此外，BRCA1/2 雖然在進化過程中不是高度保守的，仍與小鼠存在約50%的同源性。研究發(fā)現(xiàn)BRCA1/2對小鼠的胚胎發(fā)育至關(guān)重要，因此推測BRCA1/2 也可能對人類胚胎發(fā)育有重要影響［5］。

BRCA1 參與同源重組修復(fù)的早期和后期步驟：在早期階段，雙鏈DNA損傷形成后，BRCA1通過對抗非同源性末端接合（non-homologous end joining，NHEJ）因子53BP1 促進DNA 末端切除；在后期階段，BRCA1與結(jié)合BRCA2的乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白2（partner and localizer of BRCA2，PALB2）蛋白相互作用，促進RAD51 細絲形成［6］。BRCA2 在DNA 同源重組修復(fù)中的關(guān)鍵功能是促進RAD51細絲組裝到最終切除后的單鏈DNA。BRCA2 負責(zé)招募RAD51 細絲到DNA 損傷位點，并在修復(fù)過程中交互作用。BRCA1/2的另一個功能是與FA蛋白共同參與復(fù)制叉保護，在停滯的復(fù)制叉處保護新生的DNA 鏈。在復(fù)制壓力致使復(fù)制叉停滯時，BRCA1/2 和FA 蛋白可阻止MRE11 核酸酶降解新合成的DNA 鏈。可見，BRCA1/2 既能修復(fù)DNA 損傷，又能防止DNA 損傷的發(fā)生［7］。但是，BRCA1/2 和FA 蛋白在復(fù)制叉保護中如何發(fā)揮作用，具體分子機制尚不清楚，需進一步研究。

2 常用檢測技術(shù)

BRCA1/2基因突檢測方法有多種，包括大規(guī)模平行信號測序技術(shù)（massively parallel signature sequencing，MPSS）、Sanger 測序、多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、染色體微陣列分析（chromosomal microarray，CMA）或微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridisation，aCGH）等［2］。最初，BRCA1/2的基因檢測主要通過Sanger測序和MLPA協(xié)作完成，主要包括篩選單個核苷酸突變、小片段插入/刪除和較大的拷貝數(shù)變異（CNVs）。NGS 二代測序技術(shù)出現(xiàn)后，利用單一平臺提供CNVs檢測和基因測序已成為可能，并同時具有以下三個優(yōu)點：1）檢測僅需一種方法，大幅降低了樣本的診斷周期和成本；2）NGS 所需的DNA樣本量更少；3）在CNVs檢測過程中可以避免由MLPA 引物雜交位點突變而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。然而，NGS 測序基于雜交的捕獲方法，也有自身的局限性，尤其是假基因的影響。為了規(guī)避假基因的影響，防止假基因外顯子擴增，未來可能會出現(xiàn)一種基于擴增的NGS新方法［8］。

BRCA1/2基因非常龐大，盡管基因突變檢測方法很多，但每種檢測技術(shù)均有自己的優(yōu)缺點，尚無充足的證據(jù)表明何種基因檢測方法可以完全替代另一種方法，尚無單一的一種測試可以檢測BRCA1/2 基因中所有突變，為確保檢測到全部的突變，需要同時使用多種檢測方法。基因突變的頻率因地理環(huán)境和種族來源有所不同，不同的種群有不同的突變。因此，應(yīng)該根據(jù)突變的流行病學(xué)特征選擇相應(yīng)的方法，進行針對性的檢測。

3 BRCA1/2與惡性腫瘤

3.1 BRCA1/2與惡性腫瘤的相關(guān)性

3.1.1 乳腺癌 攜帶BRCA1/2 基因突變的女性乳腺癌終生風(fēng)險為60%～85%，且發(fā)病呈年輕化趨勢［9］。盡管大多數(shù)乳腺癌是散發(fā)，僅不足5%的乳腺癌是遺傳性，但其中90%以上與BRCA1/2 有關(guān)。有研究報道BRCA1/2突變與雌激素受體表達缺失、腫瘤較大、惡性度較高等有關(guān)，往往提示分期更晚，預(yù)后更差；同樣，也增加了男性乳腺癌的患病風(fēng)險［10］。BRCA1/2突變的乳腺癌患者確診年齡和臨床分期無顯著差異。但BRCA2突變的患者乳腺鉬靶射線影像更具有惡性特征，而BRCA1 突變的患者組織病理學(xué)更具侵襲性，對側(cè)乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險顯著增加，并且與三陰性乳腺癌密切相關(guān)。但幸運的是，BRCA1/2突變的患者對鉑類和PARP 抑制劑治療療效顯著。隨著對癌癥的遺傳易感性的認識、高風(fēng)險患者風(fēng)險評估模式以及BRCA1/2檢測的應(yīng)用，識別高風(fēng)險患者，早期篩查和預(yù)防癌癥發(fā)生倍受關(guān)注。根據(jù)患者的年齡、健康要求等制定個體化的管理，包括增加動態(tài)監(jiān)測、他莫昔芬的化學(xué)預(yù)防，雙側(cè)預(yù)防性卵巢切除術(shù)和/或雙側(cè)預(yù)防性乳房切除術(shù)等。

3.1.2 卵巢癌 攜帶BRCA1/2基因突變的女性卵巢癌的終生風(fēng)險為26%～54%，BRCA1突變率高于BRCA2［9］。BRCA1/2突變約占家族性卵巢癌27%左右，基于BRCA1/2基因突變和明確家族史的新的卵巢癌風(fēng)險預(yù)測模型更準(zhǔn)確，可用于卵巢癌遺傳咨詢（http：//group.bmj.com/group/rights-licensing/permissions）［11］。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)BRCA1/2基因突變的患者表現(xiàn)為高級別漿液性病變，發(fā)病年齡較早，且具有明確的卵巢和（或）乳腺癌家族史。BRCA1/2基因突變可以作為鉑類化療藥和PAPR抑制劑在臨床應(yīng)用的重要依據(jù)。歐洲藥物管理局批準(zhǔn)PARP抑制劑奧拉帕尼（olaparib）作為首次針對遺傳性腫瘤的靶向治療，也是第一種針對BRCA1/2相關(guān)基因的治療，主要用于胚系和體細胞突變腫瘤的治療［3］。

3.1.3 胰腺癌 胰腺導(dǎo)管腺癌是致死性最強的癌癥之一，遠高于其他癌癥，5年生存率僅3.0%～7.7%。大多數(shù)胰腺腺癌是散發(fā)性，僅5%～10%患者有明確的家族病史，在這些患者中，可以檢測到BRCA1、BRCA2、PALB2、CDKN2A、ATM、TP53、錯配修復(fù)基因MLH1/MSH2和MSH6等突變，其中以BRCA1/2最常見，但突變率在不同的國家和民族之間可能存在差異。BRCA1/2突變攜帶者在胰腺切除術(shù)后的生存率比野生型差。然而，基于鉑類的化療方案可以有效提高BRCA1/2突變患者的生存率，但對野生型患者的療效不明顯。PARP抑制劑是目前正在接受研究的最有前途的新藥物，可能成為結(jié)合鉑類化療誘導(dǎo)DNA損傷與修復(fù)缺陷的最佳治療策略［12-13］。因此，有必要納入具有BRCA1/2胚系突變的胰腺癌患者，進行新的前瞻性試驗。

3.1.4 前列腺癌 在原發(fā)性前列腺癌患者中，攜帶BRCA1/2突變的患者比例為1%～2%，但在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中BRCA2突變率可達5.3%。攜帶BRCA2突變年齡＜65歲的男性相對風(fēng)險指數(shù)為8.6，BRCA2突變是前列腺癌發(fā)生的重要危險因素。此外，其他DNA修復(fù)基因如PALB2、MLH1、MSH2和PMS2突變也增加了前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險。在前列腺癌篩查的研究中，以BRCA1/2突變的男性為研究對象，每年行PSA檢測，PSA＞3 ng/mL行前列腺活組織檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRCA2突變攜帶者的前列腺癌發(fā)病率顯著高于對照組，為前列腺癌高風(fēng)險人群管理策略的制定提供了可靠依據(jù)。初步研究顯示攜帶BRCA1/2突變的前列腺癌患者，對PARP抑制劑治療反應(yīng)良好。鉑類化療藥對改善前列腺患者總體生存率無效，應(yīng)用受到限制。但是隨著BRCA1/2檢測的應(yīng)用及認識，推測攜帶BRCA1/2突變的前列腺癌患者可能出現(xiàn)與BRCA1/2突變的乳腺癌、卵巢癌患者對鉑類化療藥的相似作用，而使人們開始重新評估鉑類藥物在前列腺癌中的療效。目前，關(guān)于鉑類與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用的研究正在進行中［14］?；贐RCA1/2基因突變的研究，有望為前列腺癌臨床治療提供新的策略。

3.1.5 皮膚癌 BRCA1/2突變的女性患乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險較高，常具有并發(fā)其他癌癥的風(fēng)險，包括皮膚癌。評估BRCA1/2突變與皮膚癌之間關(guān)系的研究相對較少，得出的結(jié)果也不一致。在關(guān)于BRCA1/2突變攜帶者患黑色素瘤和非黑色素瘤皮膚癌的風(fēng)險回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，尚無足夠的證據(jù)表明BRCA1突變的家系罹患惡性黑色素瘤的風(fēng)險會增加。BRCA2突變與乳腺癌和卵巢癌家系中的黑色素瘤發(fā)生有關(guān)，僅一項研究表明BRCA2突變的患者黑色素瘤發(fā)病率顯著升高，另有五項研究顯示BRCA2突變與黑色素瘤相關(guān)，而其他四項研究卻未見相關(guān)性。另外，非黑色素瘤皮膚癌的研究得出了相互矛盾的結(jié)果。這些研究的主要局限性是，未在BRCA1/2基因突變的患者中進行［15］。目前尚不清楚其與皮膚癌有關(guān)的聯(lián)系是否可以歸因于BRCA1/2突變，因此無足夠的證據(jù)證明有BRCA1/2突變家族史的患者需要加強皮膚癌監(jiān)測。盡管如此，高度可疑或已經(jīng)檢測到BRCA1/2突變的攜帶者應(yīng)該被告知皮膚癌的風(fēng)險，可能使其從每年的全面皮膚檢查中受益。另外，經(jīng)BRCA1/2基因檢測突變攜帶者的研究可能提供更可靠的證據(jù)。

3.1.6 其他 BRCA1/2基因及相關(guān)重組修復(fù)基因與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，除了乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、腦膜瘤等［16］，并且腫瘤治療的化療藥物和靶向治療藥物療效反應(yīng)具有相似的特點。

3.2 BRCA1/2檢測與惡性腫瘤治療的選擇

3.2.1 化療藥物 BRCA1/2 及其它參與同源重組修復(fù)基因PALB2、RAD51C、RAD51D 和ATM 等發(fā)生突變后，有著相同癌癥疾病譜，統(tǒng)稱為BRCAness。這些基因突變后，均可導(dǎo)致DNA同源重組修復(fù)功能缺陷，致使DNA對交聯(lián)劑造成的損傷難以修復(fù)。臨床研究證實BRCA1/2 突變的乳腺癌和卵巢癌患者對導(dǎo)致DNA交聯(lián)的化療藥物更加敏感，如順鉑、卡鉑和絲裂霉素等。2B 類證據(jù)顯示，晚期或者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，若存在BRCA1/2胚系突變，制定化療方案時可以優(yōu)先考慮鉑類藥物［3］。BRCA1/2 突變在鉑類藥物選擇中起到?jīng)Q策性的作用。

3.2.2 PARP抑制劑 PARP1和PARP2是細胞周期S期活性最強的DNA損傷感受器，在DNA修復(fù)中發(fā)揮重要作用。PARP抑制劑是靶向ADP-核糖聚合酶的抑制劑，相關(guān)的臨床研究主要集中于具有BRCA1和（或）BRCA2胚系突變的乳腺癌和卵巢癌患者。PARP抑制劑可以導(dǎo)致DNA單鏈損傷修復(fù)受損，進而形成DNA雙鏈損傷，當(dāng)機體同源重組修復(fù)的基因同時發(fā)生突變時，會形成致死性DNA損傷，最終導(dǎo)致腫瘤細胞死亡［17］。BRCA1/2突變的患者，甚至連同其他同源重組修復(fù)相關(guān)的基因突變的患者，從理論上講，均可作為PARP抑制劑治療選擇的依據(jù)。

3.2.3 PD-1抗體 免疫療法已經(jīng)證明對多種癌癥具有顯著功效，關(guān)鍵是新抗原的發(fā)現(xiàn)。腫瘤細胞中高突變負荷可以導(dǎo)致更多的新抗原和更高的免疫原性。DNA修復(fù)缺陷增加也被認為是增強抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要因素［18］。研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1基因突變與三陰性乳腺癌較高的突變負荷相關(guān)，順鉑與抗程序性死亡受體1（programmed cell death protein，PD-1）/抗細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4）聯(lián)合治療比單獨使用順鉑能更有效地抑制腫瘤的生長。在BRCA2基因突變黑素瘤中鑒定顯示，其對抗PD-1療法的反應(yīng)更佳。這些研究表明可以利用BRCA1/2（包括其它同源重組修復(fù)基因）的突變狀態(tài)來預(yù)測抗PD-1免疫治療的療效。此外，免疫檢查點阻斷治療與化學(xué)療法結(jié)合的應(yīng)用，可以提高同源重組基因缺陷腫瘤患者的的療效。

3.2.4 ALDH2抑制劑 醛類物質(zhì)是細胞自身代謝的副產(chǎn)物，可以內(nèi)生，也有外在的來源，如煙草中含有豐富的甲醛，酒精代謝的產(chǎn)物是乙醛。這些醛類的致癌作用源于過度暴露和細胞醛降解過程的飽和，從而導(dǎo)致DNA-DNA和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)并最終誘發(fā)癌變。乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是人體內(nèi)乙醛代謝過程中最重要的酶，戒酒硫已被批準(zhǔn)用于治療慢性酒精中毒，BRCA1/2缺陷者對戒酒硫的治療敏感，細胞機制表現(xiàn)為復(fù)制應(yīng)激、DNA雙鏈損傷、染色體畸變和免疫檢查點激活［19-20］。這些發(fā)現(xiàn)提示戒酒硫和其他ALDH2抑制劑的潛在臨床應(yīng)用，將來有可能作為治療BRCA1/2 缺陷腫瘤患者的抗腫瘤藥物。

3.2.5 mTOR 抑制劑 PI3K-AKT-mTOR 途徑最重要的作用是促進細胞增殖和抗凋亡，最新的研究發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT-mTOR 參與細胞DNA損傷修復(fù)。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑與PARP 抑制劑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗腫瘤作用，并可以改善PARP抑制劑耐藥。盡管研究表明mTOR 抑制劑的作用不依賴于BRCA1/2 突變［21-22］，但是從理論上推測，對于BRCA1/2 突變的患者，DNA 損傷修復(fù)存在缺陷，mTOR 抑制劑的療效可能更好，雷帕霉素等藥物可能成為BRCA1/2 突變患者治療的另一個選擇方向。

3.3 BRCA1/2檢測與惡性腫瘤風(fēng)險預(yù)測

風(fēng)險預(yù)測模型是一種統(tǒng)計學(xué)工具，用于預(yù)測具有特定危險因素的健康人群發(fā)生某種疾病如乳腺癌的概率。癌癥風(fēng)險預(yù)測最成功的模型基于乳腺癌。在乳腺癌風(fēng)險預(yù)測中獲得的罹患乳腺癌的絕對風(fēng)險，是指具有特定危險因素但無乳腺癌的婦女在a＜T≤a+τ年齡區(qū)間內(nèi)被診斷為乳腺癌的概率（τ為風(fēng)險預(yù)測區(qū)間）［23］。最早出現(xiàn)的乳腺癌風(fēng)險模型是1989年出現(xiàn)的Gail模型，隨后有Couch、Shattuck-Eidens、Frank 和BRCAPRO、BOADICEA和IBS等，這些模型在評估和降低人乳腺癌發(fā)病風(fēng)險中起到了重要作用。目前研究資料表明，囊括了BRCA1/2基因信息的模型對乳腺癌風(fēng)險預(yù)測更具有優(yōu)勢。甚至，BRCA1/2突變檢測結(jié)果本身，也可以單獨作為乳腺癌風(fēng)險預(yù)測的依據(jù)。

BRCA1/2突變后導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)病風(fēng)險增加，與其他參與同源重損傷修復(fù)的基因有著相同的癌癥發(fā)病譜。但各種癌癥發(fā)病風(fēng)險不盡相同，推測可能與個體差異、環(huán)境因素和各器官生理差異等有關(guān)。

就癌癥防治而言，乳腺癌的高風(fēng)險患者管理研究最多。目前降低乳腺癌和卵巢癌發(fā)生的措施有避免危險因素的暴露、早期篩查、藥物干預(yù)和手術(shù)預(yù)防性切除等。就其他癌癥而言，避免危險因素暴露、早期篩查仍然是最主要的降低癌癥發(fā)病風(fēng)險的方法。

4 結(jié)語

BRCA1/2是廣譜的抑癌基因，隨著基因檢測技術(shù)的進步，BRCA1/2 檢測越來越多地應(yīng)用于臨床，在臨床治療方案的制定中起決策性作用。BRCA1/2 突變患者對含鉑類化療方案敏感，對PARP 抑制劑和抗PD-1 藥物療效確切，戒酒硫和mTOR 抑制劑雷帕霉素等有望成為BRCA1/2突變患者新的選擇。BRCA1/2檢測還可以用于預(yù)測癌癥風(fēng)險，篩查和管理高風(fēng)險人群。檢測到明確致病突變位點，提示受檢者處于極高的患癌風(fēng)險之中?；驒z測的診斷無直接風(fēng)險，不需要過度預(yù)警［24］。BRCA1/2檢測也面臨著更多的挑戰(zhàn)，如很難找到BRCA1/2致病突變熱點、檢測技術(shù)自身存在缺陷，實驗室之間缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，檢測報告的解讀等。