趙霄，葉進(jìn)

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210009)

隨著兒童青春期發(fā)育提前啟動(dòng)、第二性征提早出現(xiàn)的情況逐年增加，性早熟這一疾病引起了廣泛的社會(huì)關(guān)注。性早熟是指女童在8歲前，男童在9歲前呈現(xiàn)第二性征的發(fā)育異常性疾病。根據(jù)發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)可分為中樞性(促性腺激素釋放激素依賴性，真性)性早熟(central precocious puberty,CPP)和外周性(非促性腺激素釋放激素依賴性，假性)性早熟。其中以中樞性性早熟(CPP)最為常見[1]。臨床研究表明，女童的發(fā)病率明顯高于男童[2]，且女童中的肥胖者多存在第二性征提前發(fā)育的情況[3]。《張聿青醫(yī)案》中提到：“形體豐者多痰濕”，朱丹溪在《丹溪心法》中也多次提到“肥人多痰濕”。痰濕壅滯證是由于水谷精微運(yùn)化失司，導(dǎo)致體內(nèi)痰濕凝聚、停滯，以黏滯重濁為主要特征的證候。女童性早熟(真性)痰濕壅滯證臨床多表現(xiàn)為提前乳房發(fā)育，陰道分泌物增多，陰唇發(fā)育，色素沉著，月經(jīng)來潮，伴形體偏肥胖，胸悶嘆息，肢體困重，口中黏膩，多食肥甘，舌質(zhì)紅、苔膩，脈滑數(shù)，患兒同時(shí)伴有線性加速生長[4]。這些表現(xiàn)會(huì)給患兒個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來諸多不良影響。因此，深入研究性早熟(真性)痰濕壅滯證具有重要意義，關(guān)系到兒童身心健康、家庭幸福、社會(huì)和諧及醫(yī)療水平提高。

目前，國內(nèi)外對于CPP動(dòng)物模型的建立主要有3種，包括達(dá)那唑[5]和N-甲基-DL-天冬氨酸(NMA)[6]誘導(dǎo)的雌性SD大鼠，以及瘦素(leptin)誘導(dǎo)BALB/c雌性小鼠CPP模型[7]。這3種模型對人們認(rèn)識及研究該疾病起到至關(guān)重要的作用。在國內(nèi)大量實(shí)驗(yàn)研究中，多采用高脂飲食的方法構(gòu)建痰濕壅滯證大鼠模型[8-10]。通過觀察模型大鼠的體重，形態(tài)，皮毛，活動(dòng)度等表現(xiàn)檢驗(yàn)造模成功與否。本實(shí)驗(yàn)選擇了較為常用的達(dá)那唑誘導(dǎo)5日齡雌性SD大鼠建立的CPP模型，并運(yùn)用高脂飲食構(gòu)建痰濕壅滯證模型的方法，進(jìn)一步建立了性早熟痰濕壅滯證雌性SD大鼠模型，將青春期發(fā)育及痰濕壅滯證候的相關(guān)指標(biāo)、行為學(xué)特征與正常組比較，為完善性早熟痰濕壅滯證雌性SD大鼠模型評價(jià)方法提供實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級SD大鼠，雌性， 270～300 g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(浙)2014-0001】，。高脂飼料與普通飼料均由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場提供，高脂飼料由20%豬油、4%白糖、2%奶粉、1%膽固醇、73%普通飼料組成，每100 g高脂飼料提供453kcal熱量[8]，大鼠均可自由飲水。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(蘇)2012-0042】，溫度、適度分別控制在20～24℃、45%～55%。實(shí)驗(yàn)倫理審批號為[201810A022]。

1.1.2 試劑及儀器

達(dá)那唑膠囊(20161202)江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，無水乙醇分析純(10009257)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乙二醇分析純(20161201)江蘇強(qiáng)生功能化學(xué)股份有限公司。曠場實(shí)驗(yàn)設(shè)備購自北京碩林苑科技有限公司，設(shè)備包括黑色曠場實(shí)驗(yàn)箱(100 cm×100 cm×30 cm)，小動(dòng)物行為活動(dòng)記錄分析圖像采集電腦控制系統(tǒng)(SLY-ETS Version 1.66)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物建模

適應(yīng)性喂養(yǎng)SPF級6周齡雌性SD大鼠與雄性SD大鼠1周后，將其隨機(jī)分為兩組：分別為親代模型組(雌鼠n=12，雄鼠n=6)和親代對照組(雌鼠n=6，雄鼠n=6)。親代模型組以高脂飼料飼喂8周造模，親代對照組以普通大鼠飼料飼喂，8周后篩選體質(zhì)量大于親代對照組20%的模型組親代大鼠體進(jìn)行交配。繁殖的雌性仔鼠設(shè)定為模型組仔鼠，即性早熟痰濕壅滯組(n=11)，親代對照組大鼠繁殖的雌性仔鼠作為對照組仔鼠，分成兩組(性早熟非痰濕壅滯組n=15，空白對照組n=14)。性早熟痰濕壅滯組和性早熟非痰濕壅滯組仔鼠在出生后5日齡一次性給予皮下注射達(dá)那唑300 μg；模型組仔鼠造模方法與模型組親代大鼠相同，均為同配方高脂飼料飼喂，對照組仔鼠則用普通飼料飼喂。

1.2.2 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場實(shí)驗(yàn)箱為黑色，運(yùn)用小動(dòng)物行為活動(dòng)記錄分析系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)箱底部劃出1個(gè)100 cm×100 cm的方格。實(shí)驗(yàn)于白天9：00～17：00進(jìn)行，將大鼠輕柔地置于實(shí)驗(yàn)箱中央?yún)^(qū)域，電腦軟件統(tǒng)計(jì)大鼠的運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)速度、靜止時(shí)間、靜止次數(shù)等數(shù)據(jù)，攝像頭跟蹤描繪動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡。親代大鼠于喂養(yǎng)8周后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，繁殖的雌性仔鼠在4周齡進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)5 min。每只動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)束后，清除動(dòng)物糞便，消毒液清洗實(shí)驗(yàn)箱底部及內(nèi)壁，然后用75%乙醇擦拭，風(fēng)扇吹干后放入下一只動(dòng)物。

注：A.性早熟痰濕壅滯組肝；B.空白對照組肝；C.性早熟非痰濕壅滯組肝；D.性早熟痰濕壅滯組腹部脂肪；E.空白對照組腹部脂肪；F.性早熟非痰濕壅滯組腹部脂肪。圖1 仔鼠各組肝及脂肪組織肉眼觀察圖Note. A. Liver of the precocious puberty with phlegm-dampness group. B. Liver of the blank control group. C. Liver of the precocious puberty without phlegm-dampness group. D. Adipose tissue of the precocious puberty with phlegm-dampness group. E. Adipose tissue of the blank control group. F. Adipose tissue of the precocious puberty without phlegm-dampness group.Figure 1 Visual observation of liver and adipose tissue in the young rat groups

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般表現(xiàn)

親代雌性大鼠在不同飼料分別喂養(yǎng)8周后，親代模型組雌鼠較親代對照組呈現(xiàn)出活動(dòng)度下降，排泄物黏膩臭穢，毛發(fā)色澤暗淡無光、無稀疏。4周齡雌性仔鼠中，性早熟痰濕壅滯組雌鼠較對照組呈現(xiàn)活動(dòng)度下降，排泄物量多、黏膩、臭穢，毛發(fā)稀疏、色暗無光；性早熟非痰濕壅滯組與空白對照組在活動(dòng)度、排泄物、毛發(fā)色澤等方面無明顯差異。雌性仔鼠分別于建立第一個(gè)發(fā)情期后動(dòng)情前期處死，肉眼可見：性早熟痰濕壅滯組肝輕微腫大，包膜緊張，切面略膨隆，質(zhì)地較軟，色澤淡黃，有油膩感，性早熟非痰濕壅滯組及空白對照組肝呈紫紅色，邊緣薄銳，表面濕潤光滑；性早熟痰濕壅滯組腹部脂肪組織豐富，質(zhì)軟，有油膩感，成乳白色，性早熟非痰濕壅滯組及空白對照組脂肪含量未見明顯異常(圖1)。通過肉眼觀察大鼠活動(dòng)度、毛發(fā)色澤與疏密程度、排泄物性狀，以及肝的、脂肪組織等，可初步檢查痰濕壅滯模型造模成功與否。

2.2 各組大鼠體重比較

親代模型組雌鼠較親代對照組體重未見顯著性差異(302.81±16.39)VS(303.72±13.25)g(P> 0.05)；親代模型組雌鼠較親代對照組喂養(yǎng)8周后與8周前體重增長量未見明顯差異(84.10±15.07)VS(94.30±11.26)g(P> 0.05)，差異無顯著性。4周齡雌性仔鼠中，性早熟痰濕壅滯組雌鼠較空白對照組體重有較明顯差異(57.38±8.71)VS(74.58±8.53)g(P< 0.05)，且性早熟痰濕壅盛組與性早熟非痰濕壅滯組體重之比為(57.38±8.71)VS(68.53±6.57)g(P< 0.05)，差異具有顯著性；性早熟非痰濕壅滯組與空白對照組體重?zé)o明顯差異(68.53±6.57)VS(74.58±8.53)g(P> 0.05)。通過比較5組大鼠體重的差異度，觀察高脂飲食對大鼠體重的影響(圖2)。同時(shí)，親代雌性大鼠給予的飼料不同，食入量上也有較明顯差距。通過計(jì)算大鼠進(jìn)食量，為體重變化提供了相關(guān)依據(jù)(圖3)。

圖2 各組大鼠體重柱狀圖Figure 2 The weight histogram of each group

圖3 每六只親代雌性SD大鼠每日進(jìn)食量檢測圖Figure 3 Daily food intake of every group of six parental rats

2.3 曠場實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

結(jié)果顯示，親代模型組雌性SD大鼠在總運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)速度上較親代對照組明顯減少(P< 0.05)，在靜止次數(shù)與靜止時(shí)間上明顯高于親代對照組(P< 0.05)。然而，性早熟痰濕壅滯組、性早熟非痰濕壅滯組及空白對照組在運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)速度、靜止次數(shù)和靜止時(shí)間上并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P> 0.05)。對比5組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)數(shù)據(jù)，能夠?qū)Υ笫蠡顒?dòng)情況有更清楚的認(rèn)識，進(jìn)一步探索痰濕壅滯證性早熟模型大鼠的行為學(xué)指標(biāo)(表1)(圖4)。

2.4 雌性仔鼠青春期發(fā)育判定指標(biāo)

各組雌性仔鼠陰門開啟時(shí)間與建立第一個(gè)發(fā)情期后動(dòng)情前期時(shí)間比較：性早熟痰濕壅滯組陰門開啟時(shí)間與性早熟非痰濕壅滯組無明顯差異(P> 0.05)，但較空白對照組陰門開啟時(shí)間有明顯的提前(P< 0.001)，性早熟非痰濕壅滯組陰門開啟時(shí)間較空白對照組也出現(xiàn)了提前(P< 0.001)；性早熟痰濕壅滯組第一個(gè)發(fā)情期后動(dòng)情前期時(shí)間與性早熟非痰濕壅滯組無明顯差異(P> 0.05)，但較空白對照組有明顯的提前(P< 0.001)，同樣，性早熟非痰濕壅滯組第一個(gè)發(fā)情期后動(dòng)情前期時(shí)間較空白對照組出現(xiàn)了提前(P< 0.001)。比較雌性仔鼠青春期發(fā)育的判定指標(biāo)，可驗(yàn)證性早熟模型的造模成功(表2)。

3 討論

系統(tǒng)評價(jià)中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型對于此類動(dòng)物模型的成功構(gòu)建具有十分重要的意義。理想的中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與中醫(yī)臨床病癥診斷標(biāo)準(zhǔn)保持一致性，包括四診情況、癥狀體征等，但建立完善的中醫(yī)病癥結(jié)合動(dòng)物模型的系統(tǒng)評價(jià)存在著巨大困難。目前大多數(shù)的病證結(jié)合動(dòng)物模型的評價(jià)來源于臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，但仍有部分臨床病癥診斷標(biāo)準(zhǔn)無法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中體現(xiàn)出來，例如舌象、脈象、咯痰、少動(dòng)懶言等，此類研究還需要與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)、動(dòng)物行為學(xué)等諸多學(xué)科共同研究探討。

表1 曠場實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 The open-field test data

注：與親代對照組相比，*P< 0.05?？倳r(shí)長為300 s。

Note. Compared with the parental control group,*P< 0.05.

注：A.親代模型組；B.親代對照組；C.性早熟痰濕壅滯組；D.性早熟非痰濕壅滯組；E.空白對照組。圖4 各組曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡圖Note. A. Parental model group. B. Parental control group. C. Precocious puberty with phlegm-dampness group. D. Precocious puberty without phlegm-dampness group. E. The blank control group.Figure 4 Typical motion trajectory of the rats in the open-field test

組別Groups只數(shù)(只)Number(n)陰門開啟時(shí)間(天)Vaginal opening(Day)第一個(gè)發(fā)情期后動(dòng)情前期時(shí)間(天)Preoestrus(Day)性早熟痰濕壅滯組Precocious puberty with phlegm-dampness group1135.18±4.00**39.55±4.08**性早熟非痰濕壅滯組Precocious puberty without phlegm-dampness group1534.53±1.41**38.67±1.29**空白對照組 Blank control group1442.44±2.0746.33±2.45

注：與空白對照組比較，**P< 0.001。

Note. Compared with the blank control group,*P< 0.05.

通過本次實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)親代模型組和親代對照組大鼠模型的曠場實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果有重要意義。高脂飼料喂養(yǎng)8周較普通飼料喂養(yǎng)的雌性SD大鼠運(yùn)動(dòng)距離與運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯縮短、靜止次數(shù)增多、靜止時(shí)間增長，這與臨床上痰濕壅滯證候中肢體困重、少動(dòng)有一定相似性，可見痰濕壅滯證候大鼠模型在行為學(xué)中的改變與該證候臨床表現(xiàn)具有一致性，可進(jìn)一步研究曠場實(shí)驗(yàn)作為痰濕壅滯證動(dòng)物模型評價(jià)的方法之一的可行性。然而，雌性仔鼠各組間未發(fā)現(xiàn)行為學(xué)方面的顯著性差異，考慮仔鼠進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)時(shí)尚未成熟，因此該實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能作為最終結(jié)論，性早熟痰濕壅滯組與性早熟非痰濕壅滯組、空白對照組仍存在行為學(xué)方面差異的可能性，有待于進(jìn)一步研究。

親代與子代雌性大鼠模型組與對照組體重對比顯示，高脂飼料喂養(yǎng)8周后的雌性SD大鼠與普通飼料喂養(yǎng)8周后的雌性SD大鼠在體重及體重增長量上無顯著差異。由于高脂飼料中含有豬油、白糖、奶粉、膽固醇等高熱量成分，長期食入且作為唯一食物，使得進(jìn)食量逐漸減少，且較親代對照組明顯減少(見圖3)。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)中高脂飼料喂養(yǎng)下的SD孕鼠難產(chǎn)率為23.08%，較普通飼料喂養(yǎng)下的SD孕鼠高。高脂飼料喂養(yǎng)下的SD孕鼠與較普通飼料喂養(yǎng)下的SD孕鼠所繁殖的雌性仔鼠在體重上明顯減輕?？梢娔甘蟾咧嬍澄茨茉谠黾哟菩宰惺篌w重中起決定性作用。因此，在性早熟痰濕壅滯證動(dòng)物模型的系統(tǒng)評價(jià)中，體重是重要的但并非關(guān)鍵性的評價(jià)方法。

判斷雌性大鼠青春期啟動(dòng)的決定因素是陰道開啟時(shí)間和第一次排卵的發(fā)生，第一次排卵發(fā)生的間接指征是第一個(gè)發(fā)情期后動(dòng)情前期的出現(xiàn)[11]。本實(shí)驗(yàn)中，性早熟痰濕壅滯組和性早熟非痰濕壅滯組的青春期啟動(dòng)時(shí)間均較空白對照組提前(P< 0.001)(表2)?？梢?，達(dá)那唑誘導(dǎo)的雌性SD大鼠建立CPP模型的方法具有較好的可行性。

在本次實(shí)驗(yàn)中，作者僅采用了一種高脂飼料構(gòu)建痰濕壅滯證SD大鼠模型，未能進(jìn)行多種不同成分、含量的高脂飼料喂養(yǎng)的比較，因此結(jié)果存在單一性；此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)的時(shí)間為4周齡，而仔鼠斷奶時(shí)間為21日齡，未能進(jìn)行較長時(shí)間的高脂飲食可能是導(dǎo)致行為學(xué)特征無顯著差異的重要原因，并且未能進(jìn)行多次曠場實(shí)驗(yàn)，對實(shí)驗(yàn)的完整性、全面性、重復(fù)性方面有所欠缺。在接下來的試驗(yàn)研究中，將會(huì)不斷改進(jìn)、完善，以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性及準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)之一在于運(yùn)用了行為學(xué)方法研究痰濕壅滯證雌性SD大鼠模型評價(jià)方法，將曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)用于痰濕壅滯證候動(dòng)物模型的系統(tǒng)評價(jià)，為曠場實(shí)驗(yàn)與痰濕壅滯證動(dòng)物模型評價(jià)之間建立了連接紐帶，給痰濕壅滯證動(dòng)物模型的系統(tǒng)評價(jià)提供了新的方法。第二，通過此次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高脂飲食未能使雌性SD大鼠體重增加，體重指標(biāo)存在不能作為痰濕壅滯證候動(dòng)物模型系統(tǒng)評價(jià)關(guān)鍵指標(biāo)的可能性。