許 琴, 董 翔, 李建瑛, 張東輝, 李佳佳, 楊亞萍,楊秋月, 是文輝, 馬娜 , 宋來(lái)陽(yáng), 劉江偉

(1. 新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830000;2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院, 烏魯木齊 830052)

中暑是指在高溫作業(yè)環(huán)境，由于熱平衡或水鹽代謝紊亂而引起的以中樞神經(jīng)和心血管障礙為主要表現(xiàn)的急性疾病，常表現(xiàn)為驚厥、昏迷以及高體溫[1]。沙漠干熱具有一系列特征，如紫外線強(qiáng)度高，降雨量和水量少，極端干燥和炎熱, 使得在沙漠干熱環(huán)境下工作的人中暑風(fēng)險(xiǎn)更高[2]。相關(guān)研究[3]表明，重癥中暑是由過(guò)高熱引起的類膿毒癥樣急癥，其病死率近幾年在持續(xù)增高。

正常人體腸道內(nèi)寄居著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物, 以細(xì)菌為主, 統(tǒng)稱為腸道菌群, 其細(xì)胞總數(shù)高達(dá)1014、種類大于1 000種, 是人體細(xì)胞總和的10倍[4]。腸道內(nèi)正常菌群對(duì)外襲菌的定植抵抗力及菌群的聚集構(gòu)成了腸道的生物屏障[5]，可防止腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素侵入血液循環(huán)。近期研究[6]表明,細(xì)菌內(nèi)毒素在中暑發(fā)生中起著不可忽視的作用。

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種物質(zhì)，也是姜黃發(fā)揮藥理作用最重要的活性成分[7]。近年來(lái), 姜黃素的生物學(xué)活性受到廣泛關(guān)注, 其抗腫瘤、抗炎癥及器官保護(hù)等作用均被發(fā)現(xiàn)，目前美國(guó)國(guó)立腫瘤所已把姜黃素列為第三代抗癌化學(xué)藥物[8]。

我們推測(cè)姜黃素可能在沙漠干熱中暑的防治方面具有一定作用，本實(shí)驗(yàn)從回腸、結(jié)腸內(nèi)各菌群表達(dá)量的變化來(lái)觀察姜黃素對(duì)沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠的預(yù)防作用，探討其在沙漠干熱環(huán)境中暑防治中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 SD 大鼠，220～250 g, 購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK (新)2012-001]。5只一籠于SPF飼養(yǎng)間IVC籠盒內(nèi)預(yù)飼一周，飼養(yǎng)室溫度為 25±0.5 ℃，明暗各12 h循環(huán)，大鼠自由采食，供給滅菌酸化水[SYXK(新)2012-003]。

1.1.2 試劑 姜黃素購(gòu)自日本 TCI公司(C0434), 羧甲基纖維素鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，戊巴比妥鈉購(gòu)自德國(guó)默克公司， GoodViewTM核酸染料、DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程公司，DNA試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-tek公司，PCR引物由北京華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙為專利產(chǎn)品[9-14]; 多功能生理信號(hào)儀420購(gòu)自成都儀器廠; 臺(tái)式低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司; 微型低速離心機(jī)購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司; IVC飼養(yǎng)籠盒購(gòu)自意大利TechPlus公司; 溫度梯度PCR儀、核酸電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司; 全能型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司; 超微量微孔板分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tex公司。

1.2 方法

1.2.1 姜黃素配制和動(dòng)物分組 53 kHz, 65 ℃超聲配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%羧甲基纖維素鈉, 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉生理鹽水為溶劑，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 mg/mL的姜黃素混懸液。姜黃素一般于灌胃前1 d配制，于每次灌胃前均經(jīng)53 kHz，37 ℃超聲30 min，灌胃時(shí)充分混勻。

雄性 SD大鼠50只, 隨機(jī)分為5組, 每組10只,包括常溫常濕空白組、輕度中暑組、中度中暑組、重度中暑組、重度中暑姜黃素干預(yù)組(簡(jiǎn)稱姜黃素干預(yù)組), 除姜黃素干預(yù)組大鼠每日1次以姜黃素20 mg/100 g, 1 mL/100 g體質(zhì)量, 連續(xù)灌胃7 d。其余各組按相同體積連續(xù)灌胃生理鹽水7 d[15-18]。

1.2.2 中暑模型復(fù)制 常溫常濕空白組置于SPF飼養(yǎng)間內(nèi)，(25±0.5) ℃，相對(duì)濕度50%±2%，干熱組大鼠置于西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙模擬沙漠干熱環(huán)境中(41±0.5) ℃，相對(duì)濕度10%±2%復(fù)制中暑模型，參照實(shí)驗(yàn)室前期建立的中暑模型[19,20]。使用多功能生理信號(hào)儀420檢測(cè)大鼠核心體溫，即將多功能生理記錄儀中的溫度探頭經(jīng)液體石蠟浸潤(rùn)后, 由肛門旋轉(zhuǎn)進(jìn)入大鼠直腸約3 cm處, 待記錄儀上溫度曲線基本保持平穩(wěn)后(約30 s)，讀取記錄儀上的溫度值，即為此時(shí)受試大鼠的核心體溫。大鼠分別在干熱實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)熱暴露(50±5) min, 核心體溫達(dá)到 39.5～40.6℃,暴露(100 ± 5) min, 核心體溫達(dá)到 40.4～41.2 ℃,暴露(150 ± 5) min, 核心體溫達(dá)到41.2～42.5 ℃, 造成輕、中、重度中暑模型。受試大鼠給藥進(jìn)艙后, 嚴(yán)格按時(shí)間與核心體溫進(jìn)行篩選，因個(gè)別給藥操作不當(dāng)，刺激受試動(dòng)物咽喉或受試動(dòng)物耐熱性個(gè)體差異的存在, 淘汰中途死亡及核心體溫未達(dá)標(biāo)動(dòng)物, 保證各組納入分析的動(dòng)物數(shù)≥6只。各組大鼠出現(xiàn)各中暑階段的跡象之后，即輕度中暑大鼠身體出汗，但僅局限于頭頸部，呼吸頻率加快，異常興奮, 在籠內(nèi)四處串動(dòng); 中度中暑時(shí)大鼠呼吸頻率更快, 全身出汗并已濕透, 仍然四處串動(dòng),但明顯動(dòng)作已經(jīng)遲緩, 喜歡將頭埋于其他動(dòng)物身下或墊料中; 重度中暑時(shí)動(dòng)物呼吸急促，明顯呼出時(shí)間長(zhǎng)，吸入時(shí)間短，氣體交換基本是有出無(wú)進(jìn), 全身出汗?jié)裢?，嘴角有唾液等分泌物流出，爬在籠低不動(dòng)，此時(shí)若延長(zhǎng)熱暴露時(shí)間，動(dòng)物漸漸停止呼吸死去[21]。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，把大鼠放在無(wú)菌手術(shù)臺(tái)，腹面朝上, 四肢分開, 用手術(shù)剪在腹部正中部剪開皮膚及肌肉層，注意刀尖稍向上挑以免傷及內(nèi)臟。找到胃、十二指腸后，順下找到盲腸，由回盲瓣向胃端上行越10 cm后, 剪取近胃端回腸4 cm，留取其中回腸內(nèi)容物，液氮凍存; 無(wú)菌取近盲端結(jié)腸約2 cm, 同法取其中內(nèi)容物標(biāo)號(hào)登記后，液氮凍存待測(cè)。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA的提取 液氮凍存的回、結(jié)腸內(nèi)容物采取液氮研磨法，并結(jié)合糞便細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取腸道內(nèi)容物菌群基因組DNA[22]，具體操作如下: (1)隨機(jī)取出樣品，無(wú)菌組織剪剪取0.1 g腸內(nèi)容物，放入10 mL帶蓋離心管中，加入0.2 g經(jīng)高溫干烤的玻璃珠，加入液氮并用粗玻璃棒研磨直至磨碎。(2)待液氮揮發(fā)后，按照Omega Bio-tek DNA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。(3)將提取的DNA用超微量微孔板分光光度計(jì)測(cè)DNA濃度，標(biāo)號(hào)登記后，-20℃冰箱保存待用。

1.2.5 引物的設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)針對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3至V5區(qū)大腸桿菌、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬和腸球菌屬特異性引物[23-25]。引物設(shè)計(jì)見表1。引物委托北京華大基因合成。

1.2.6 PCR擴(kuò)增 以上大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌引物對(duì), 以細(xì)菌基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系均為15 μL: 2×Pre-mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，細(xì)菌DNA模板1 μL，滅菌蒸餾水 5.5 μL。

擴(kuò)增條件: 乳酸桿菌屬94 ℃預(yù)變性4 min, 94 ℃30 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 60 s, 30 個(gè)循環(huán), 72 ℃ 7 min延伸; 雙歧桿菌屬94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán), 72 ℃ 10 min延伸; 大腸桿菌屬94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min延伸; 腸球菌屬94 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃ 30 s, 54.5 ℃40 s，72 ℃ 50 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min 延伸。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 取PCR產(chǎn)物各10 μL,10 mg/L瓊脂糖凝加5 % Goodview染液, 1×TAE緩沖液，120 V穩(wěn)壓電泳25 min左右，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜, 檢查擴(kuò)增效果，用UVP配套圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，計(jì)算各菌種的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所得數(shù)據(jù)以x- ±s表示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各類細(xì)菌相對(duì)表達(dá)量的比較用 SPSS 22.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 兩兩比較選用LSD法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠回腸內(nèi)容物菌群表達(dá)量的變化

運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)自帶分析軟件，對(duì)各組大鼠回內(nèi)容物DNA基因組擴(kuò)增得到的各菌種擴(kuò)增目的片段進(jìn)行灰度分析，得到各菌種的平均吸光度值，以此值來(lái)分析各菌種的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見表2。

由表2可看出，各組大鼠回腸內(nèi)容物腸球菌的表達(dá)量與常溫常濕組比較，中度、重度中暑組極顯著增加(P＜0.01)，隨中暑程度的加深，回腸腸球菌的表達(dá)量急劇增加(P＜0.01)，而姜黃素干預(yù)后，與重度中暑組比較，腸球菌的表達(dá)量極顯著下降(P＜0.01)。大腸桿菌的表達(dá)量，與常溫常濕組比較，輕度中暑組顯著增加(P＜0.05)，中度、重度中暑組極顯著增加(P＜0.01)，隨中暑程度的加深，回腸大腸桿菌的表達(dá)量極顯著增加(P＜0.01)，而姜黃素干預(yù)后，與重度中暑組比較，大腸桿菌的表達(dá)量極顯著下降(P＜0.01)。雙歧桿菌的表達(dá)量與常溫常濕組比較，輕度中暑組顯著降低(P＜0.05),中度、重度中暑組及姜黃素干預(yù)組均極顯著降低(P＜0.01), 而姜黃素干預(yù)后, 與重度中暑組比較表達(dá)量有顯著回升，但未達(dá)到常溫常濕環(huán)境組水平。乳酸桿菌的表達(dá)量組間比較均未發(fā)生明顯變化。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequence

表 2 各組大鼠回腸內(nèi)容物菌群表達(dá)量的多重比較Table 2 Multiple statistics comparison on microflora expression of ileum content in different groups

表 3 各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群表達(dá)量的多重比較Table 3 Multiple statistics comparison on microflora expression of colon content in different groups

2.2 各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群表達(dá)量的變化

由表3可知, 與常溫常濕組比較, 各組結(jié)腸中腸球菌的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05或P＜0.01), 姜黃素干預(yù)后結(jié)腸腸球菌的表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)，并基本達(dá)到常溫常濕環(huán)境組水平。大腸桿菌的表達(dá)量與常溫常濕組比較, 重度中暑組顯著增加(P＜0.05),姜黃素干預(yù)后，與重度中暑組比較，大腸桿菌表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)，并接近常溫常濕組水平。各組結(jié)腸中乳酸桿菌的表達(dá)量，輕度、中度、重度中暑組差異不顯著，使用姜黃素后沒(méi)有增加其表達(dá)量。各組結(jié)腸中雙歧桿菌的表達(dá)量，輕度、重度中暑極顯著降低(P＜0.01)，而中度中暑時(shí)，由于機(jī)體的自身代償，雙歧桿菌的表達(dá)量極顯著增加(P＜0.01)。姜黃素干預(yù)后，結(jié)腸雙歧桿菌的表達(dá)量極顯著增加(P＜0.01)。

3 討論

中暑是因人體在熱環(huán)境中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(或在烈日下暴曬)，而發(fā)生的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)障礙為主的急性疾病，是熱應(yīng)激癥候群的總稱?，F(xiàn)有研究[26]表明，中暑是熱失代償引起的類膿毒癥樣反應(yīng)，炎癥因子的大量釋放及由此引發(fā)的過(guò)度免疫是引起機(jī)體死亡的原因之一。重癥中暑多繼發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，而由此引發(fā)多器官功能障礙(MODs)是其主要死亡原因，重癥中暑死亡率極高且預(yù)后不良，目前國(guó)內(nèi)不時(shí)有重癥中暑的報(bào)道，中暑的預(yù)防工作應(yīng)受到足夠重視[27,28]。相關(guān)研究[29]表明, 高溫應(yīng)激會(huì)引起腸道菌群結(jié)構(gòu)改變, 諸如雙歧桿菌和乳酸桿菌等被視為有保護(hù)作用的細(xì)菌總數(shù)下降，而腸球菌和大腸桿菌等有害健康的種群數(shù)目增加。本實(shí)驗(yàn)據(jù)此對(duì)不同程度中暑大鼠回腸與結(jié)腸內(nèi)容物菌群表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示回腸與結(jié)腸內(nèi)條件致病菌大腸桿菌、腸球菌的表達(dá)量顯著增加, 正常生理狀況下，消化道菌群的數(shù)量自口腔至結(jié)腸是逐漸增加的，而在重癥中暑時(shí)則出現(xiàn)了倒置的病理狀況，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步為中暑是由過(guò)高熱引起的類膿毒癥樣急癥提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。大鼠長(zhǎng)時(shí)間暴露于高溫干熱環(huán)境中, 體表水分大量流失，表面靜脈血管擴(kuò)張充盈，血流重新分配，導(dǎo)致內(nèi)臟處于相對(duì)缺血缺氧狀態(tài), 腸道對(duì)缺血缺氧非常敏感, 大量氧自由基堆積及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引發(fā)DIC，致使腸道黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落, 腸道黏膜物理屏障、黏膜免疫屏障、腸道黏膜生物屏障遭到破壞, 加之腸道菌群穩(wěn)態(tài)被打破, 大量條件致病菌增值, 腸道菌群移位，細(xì)菌內(nèi)毒素入血，炎癥因子大量釋放引發(fā)過(guò)度免疫, 最終導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生, 并進(jìn)展為MODs，導(dǎo)致患者死亡[30]。雖然對(duì)重癥中暑的險(xiǎn)惡及其并發(fā)癥進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)中暑的發(fā)病機(jī)制并未闡明，對(duì)其救治仍然沒(méi)有找到有效方案，仍需要進(jìn)行不斷研究找到更多防治藥物與救治方法。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將姜黃素提前灌胃給不同程度中暑的實(shí)驗(yàn)大鼠來(lái)評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)中暑后腸道有益菌和條件致病菌的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素預(yù)處理后能提高回腸與結(jié)腸內(nèi)有益菌雙歧桿菌的表達(dá)量，又能降低回腸與結(jié)腸內(nèi)條件致病菌大腸桿菌和腸球菌的表達(dá)量，而腸道正常菌群在機(jī)體消化、免疫和抗病等方面有諸多不可替代的作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明姜黃素具有調(diào)節(jié)中暑后機(jī)體消化道菌群結(jié)構(gòu)的作用，同時(shí)也提示姜黃素可能在減緩中暑大鼠腸道炎癥反應(yīng)方面有一定作用。但中暑后乳酸桿菌表達(dá)量沒(méi)有明顯改變，查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，乳酸桿菌是至今發(fā)現(xiàn)的唯一沒(méi)有致病性的一個(gè)菌種，它在人和動(dòng)物體內(nèi)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，以它為表達(dá)系統(tǒng)，較其它菌株更易達(dá)到較高的表達(dá)量[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示姜黃素可能對(duì)腸道內(nèi)乳酸桿菌沒(méi)有干預(yù)作用，其機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，姜黃素可能通過(guò)提高中暑大鼠回腸、結(jié)腸，尤其是結(jié)腸內(nèi)雙歧桿菌的表達(dá)量，抑制回腸、結(jié)腸內(nèi)大腸桿菌和腸球菌的增殖來(lái)維持中暑大鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少腸道炎癥因子對(duì)機(jī)體的侵襲，發(fā)揮對(duì)中暑的預(yù)防作用，增強(qiáng)大鼠對(duì)中暑的耐受力，結(jié)腸內(nèi)雙歧桿菌的表達(dá)受干熱中暑應(yīng)激的影響波動(dòng)較大，姜黃素抑制結(jié)腸內(nèi)雙歧桿菌表達(dá)量的減少，作用效果顯著，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。