張新艷, 關(guān)玉婷, 李大力

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院研究所, 上海 200011;2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200241)

指甲是皮膚的附屬品，具有保護(hù)手指末端皮膚, 加強(qiáng)手指運(yùn)動(dòng)力量以及維持手指精密感覺(jué)功能等作用[1,2]。因此，指甲損傷后的修復(fù)十分重要。哺乳動(dòng)物的指甲主要由四部分組成: 甲板, 甲床, 甲襞以及指甲基質(zhì)[3]。位于甲床根部區(qū)域的指甲干細(xì)胞控制著指甲和指頭的再生，然而這種能力是非常有限的: 如果指頭在超過(guò)指甲的地方被截掉(也就是干細(xì)胞區(qū)被破壞)是不會(huì)再生的。2013年, Takeo等[4]發(fā)現(xiàn)了位于指甲干細(xì)胞區(qū)域遠(yuǎn)端的指甲祖細(xì)胞在一個(gè)依賴(lài)于 Wnt 信號(hào)作用的過(guò)程中分化成指甲。目前，在指甲干細(xì)胞方面的研究報(bào)道比較少，而國(guó)內(nèi)對(duì)于該領(lǐng)域的研究基礎(chǔ)更差。本研究在前人研究基礎(chǔ)上對(duì)指甲再生模型進(jìn)行了優(yōu)化，旨在建立一套指甲干細(xì)胞研究模型，形成系統(tǒng)的指甲再生研究方法，為研究Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因在指甲再生過(guò)程中的功能提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡C57BL/6的小鼠雌雄各5只，體質(zhì)量約25 g左右，華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(滬)2016-0004]，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(滬)2015-0011]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合華東師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定并被授權(quán)。

1.2 試劑、 儀器設(shè)備

質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的水合氯醛、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛(PFA)購(gòu)自上海潤(rùn)捷化學(xué)有限公司; 各濃度梯度乙醇購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司; 尼康顯微鏡SMZ745購(gòu)自日本Nikon公司; 冰凍切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)和組織脫水一體機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Leica公司; 正置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 小鼠指甲再生模型的建立

取8周齡C57BL/6小鼠雌雄各5只，每只給予5%水合氯醛0.16 mL進(jìn)行麻醉，小鼠置于37℃加熱平板上維持體溫。在顯微鏡下逐一截取實(shí)驗(yàn)小鼠左后肢中間的三個(gè)指甲進(jìn)行取材，右后肢作為對(duì)照，截取位置如圖1A中黑實(shí)線所示，與肉眼可見(jiàn)部分的指甲根部呈約15℃角，使截取位置恰在甲床的Wnt信號(hào)激活區(qū)域[4](圖1A 右紅色區(qū)域)，同時(shí)不傷及甲床的干細(xì)胞區(qū)[4](圖1A 右綠色區(qū)域)。用酒精棉球輕柔按壓指甲傷口15 s止血。3周后，截取實(shí)驗(yàn)小鼠雙后肢中間的三個(gè)腳趾進(jìn)行取材。模型建立時(shí)間軸如圖1B所示。

1.4 模型數(shù)據(jù)的采集

造模3周后取材時(shí)，在顯微鏡下調(diào)好標(biāo)尺，分別測(cè)量實(shí)驗(yàn)小鼠正常指甲和再生指甲的長(zhǎng)度，測(cè)量位置如圖2A和2B中黑實(shí)線所示，記錄指尖最頂端與肉眼可見(jiàn)部分的指甲根部的距離。

1.5 石蠟切片的制作及染色

圖 1 小鼠指甲再生模型建立示意圖

圖 2 小鼠指甲電子顯微鏡下再生數(shù)據(jù)采集

將截下的小鼠腳趾放入盛有10% EDTA脫鈣液的1.5 mL EP管中，四度搖床上脫鈣反應(yīng)14 d。用4%多聚甲醛(PFA)在4 ℃冰箱中固定樣品過(guò)夜，用組織脫水一體機(jī)將樣品在乙醇/二甲苯中梯度脫水，最后浸蠟用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋。用石蠟切片機(jī)切成約0.5 μm厚度的切片(小鼠指甲切片只有縱軸面上的形態(tài)是完整的，所以每個(gè)腳趾包埋的蠟塊大概只能切出3～4片形態(tài)完整的切片)。將小鼠指甲的石蠟切片置于二甲苯-酒精-水梯度濃度中進(jìn)行脫蠟，蘇木精染色5 min后返藍(lán)，脫水至95%酒精時(shí)染伊紅60 s，繼續(xù)脫水，樹(shù)脂膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文中的數(shù)值均以x- ±s的形式給出，并根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)或組間t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

記錄數(shù)據(jù)顯示，在該模型下建立的小鼠再生指甲可以恢復(fù)生長(zhǎng)，與正常指甲長(zhǎng)度的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。顯微鏡下觀察小鼠指甲HE染色切片，顯示小鼠再生指甲具有與正常指甲相似的結(jié)構(gòu)形態(tài)(圖3B、3C)。

3 討論

最近研究[5]顯示，小鼠指甲附近的干細(xì)胞在指尖再生過(guò)程中是不可或缺的。進(jìn)一步說(shuō)明指甲干細(xì)胞無(wú)論是在指甲生長(zhǎng)過(guò)程中還是在指尖再生過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。在Takeo等[4]研究基礎(chǔ)上，Tabin團(tuán)隊(duì)[6]證明了G蛋白偶聯(lián)受體Lgr6在指尖再生過(guò)程中表達(dá)必不可少。但該領(lǐng)域國(guó)內(nèi)相關(guān)研究成果極少，造模時(shí)由于指甲內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)不可見(jiàn)，很容易造成同組之間指甲再生情況參差不齊。本研究對(duì)指甲再生模型進(jìn)行了量化優(yōu)化，使造模時(shí)可以在顯微鏡下準(zhǔn)確地截取至甲床的Wnt信號(hào)激活區(qū)域，為研究Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因在指甲再生過(guò)程中的作用提供了技術(shù)保障。利用該模型，可以進(jìn)一步發(fā)掘Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因(比如G蛋白偶聯(lián)受體家族)在指甲生長(zhǎng)與指尖再生過(guò)程中的功能。Shi等[7]研究表明，keratin 15 (K15), keratin 14 (K14),keratin 19 (K19), CD29, CD34和 Lgr6可能是潛在的小鼠指甲干細(xì)胞的標(biāo)記基因。可見(jiàn)，小鼠指甲干細(xì)胞領(lǐng)域具有廣闊的研究前景，該模型也需要不斷地優(yōu)化完善，成為研究指甲干細(xì)胞的有力手段。隨著該領(lǐng)域研究的不斷成熟，在不久的將來(lái)，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)指甲干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，為臨床上手指或者腳趾截肢的患者帶來(lái)治愈的新方法。

圖 3 小鼠指甲再生長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)及HE染色