小鼠滴鼻劑量與麻醉方法國(guó)內(nèi)近年文獻(xiàn)分析

鹿雙雙, 榮 蓉, 師曉萌, 劉曉宇, 盧選成

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 北京 102206)

滴鼻是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的一項(xiàng)操作。研究人員需依據(jù)動(dòng)物品種、年齡、體質(zhì)量及樣本(如病毒載量或者細(xì)菌濃度)等因素選擇既滿足實(shí)驗(yàn)要求又方便操作的滴鼻劑量及麻醉方法。本文期望通過對(duì)萬方數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的2011～2017年涉及小鼠滴鼻操作的文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，了解目前我國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)涉及小鼠滴鼻的操作中滴鼻劑量的使用情況、進(jìn)行滴鼻操作時(shí)是否使用麻醉以及具體麻醉劑使用的情況，并對(duì)可能存在的問題提出建議。

1 方法

在萬方數(shù)據(jù)庫(kù)中, 以“小鼠”和“滴鼻”為檢索詞, 檢索2011～ 2017年正文中含有檢索詞的文獻(xiàn)。按照論文中研究工作涉及小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn), 并對(duì)小鼠進(jìn)行了滴鼻操作, 篩選明確敘述了滴鼻劑量的文獻(xiàn)。按照滴鼻劑量的多少、進(jìn)行滴鼻操作時(shí)是否麻醉小鼠以及使用何種麻醉劑等內(nèi)容對(duì)選入的文獻(xiàn)進(jìn)行了整理、分析, 統(tǒng)計(jì)分析采用 Excel 2013軟件。

2 檢索結(jié)果

按照方法中描述的檢索策略，檢索出770篇文獻(xiàn)，其中513篇文獻(xiàn)明確描述了進(jìn)行小鼠滴鼻操作的劑量，其余256篇文獻(xiàn)僅提及了滴鼻的方法，未寫明滴鼻劑量，占所有文獻(xiàn)的33.4%(257/770)。

2.1 滴鼻劑量

513篇文獻(xiàn)中均敘述了進(jìn)行小鼠滴鼻操作時(shí)的劑量, 其中有4篇文獻(xiàn)對(duì)滴鼻劑量的描述為25～35 μL,但無法確定具體劑量，其余509篇文獻(xiàn)中，滴鼻劑量最小為 1 μL，最大為500 μL。將滴鼻劑量劃分為 20 μL、30 μL、50 μL、100 μL、200 μL 共5個(gè)節(jié)點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，詳見表1。

2.2 麻醉方法的使用

在513篇文獻(xiàn)中，有2篇是在小鼠清醒狀態(tài)下進(jìn)行滴鼻操作; 有253篇未提及進(jìn)行滴鼻時(shí)是否使用麻醉，占49.3%; 有10篇提到麻醉，但是對(duì)使用的麻醉劑名稱未提及; 其余249篇對(duì)滴鼻過程中使用的麻醉劑有明確的敘述, 其中3篇使用了氯胺酮和賽拉嗪混合麻醉的方式，另246篇中使用比例最高的3種麻醉劑依次是乙醚、戊巴比妥鈉和水合氯醛。文獻(xiàn)未提及使用麻醉方法的可能存在兩種情況, 一種是沒有使用麻醉，另一種是使用了麻醉, 但是文章中未描述。文獻(xiàn)中使用到的麻醉劑詳見表2。

表 1 小鼠進(jìn)行滴鼻操作時(shí)使用劑量統(tǒng)計(jì)Table 1 The statistical analysis on dosages of intranasal administration in mouse

表 2 小鼠滴鼻操作時(shí)使用麻醉劑統(tǒng)計(jì)Table 2 The statistical analysis of anesthesia used in intranasal administration

3 討論

通過對(duì)2011 ～ 2017年萬方數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的涉及小鼠滴鼻操作的文獻(xiàn)進(jìn)行整理與統(tǒng)計(jì)分析，大致了解了目前國(guó)內(nèi)進(jìn)行小鼠滴鼻操作的滴鼻劑量使用情況, 了解了滴鼻操作時(shí)是否進(jìn)行麻醉、以及麻醉時(shí)麻醉劑的使用情況。與此同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了其中存在的一些問題, 包括在撰寫論文中的一些不規(guī)范情況。

有文獻(xiàn)[1]提到小鼠的滴鼻劑量應(yīng)小于20 μL, 并認(rèn)為滴鼻劑量過多或者滴鼻過快，動(dòng)物會(huì)窒息乃至死亡。 Sonvico等[2]指出使用納米顆粒作為混懸液進(jìn)行滴鼻給藥，最大劑量不宜超過100 μL。而國(guó)內(nèi)研究報(bào)告中準(zhǔn)確敘述了小鼠滴鼻劑量的文章中有53.3%(272/509)的文章滴鼻劑量集中在 30～50 μL。在實(shí)際工作中，作者體會(huì)到如果滴鼻劑量過多，樣本會(huì)從鼻流入口腔或者以氣泡的形式噴出。根據(jù)作者的操作經(jīng)驗(yàn)，建議小鼠的滴鼻劑量應(yīng)盡量控制在50 μL以內(nèi)(單側(cè)鼻孔不超過25 μL)，如果滴鼻劑量大于50 μL，可以連續(xù)幾日進(jìn)行滴鼻。滴鼻劑量還和動(dòng)物體質(zhì)量大小以及樣本的類型以及純度(濃度)等密切相關(guān)。

滴鼻給藥是一種治療方法，藥物可繞過血腦屏障，經(jīng)嗅覺神經(jīng)和三叉神經(jīng)直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這樣既可以減少藥物的副作用又減少藥物的使用量[2,3]。胰島素在糖尿病小鼠模型[4-6]和去鐵胺在阿爾茨海默氏癥小鼠模型[7,8]的研究中, 已證明小鼠鼻內(nèi)給藥有治療效果。這種情況下, 小鼠可以在清醒狀態(tài)下給藥, 但是小鼠須經(jīng)過2～4周的馴化, 且單次給藥劑量在20～30 μL[3]。文獻(xiàn)[1]提到在進(jìn)行滴鼻操作時(shí), 小鼠應(yīng)輕度麻醉, 將樣本緩慢滴入鼻孔。如果沒有足夠的時(shí)間對(duì)小鼠進(jìn)行馴化，作者建議在進(jìn)行小鼠滴鼻操作時(shí)，應(yīng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行適當(dāng)麻醉。

對(duì)小鼠滴鼻操作中進(jìn)行麻醉的249篇文章分析,使用比例最高的3種麻醉劑依次是乙醚(51%)、巴比妥類(24%)和水合氯醛(12%)。乙醚曾經(jīng)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的麻醉藥物，乙醚對(duì)呼吸系統(tǒng)有刺激性，可增加呼吸道分泌物; 如果麻醉過深，可抑制呼吸中樞導(dǎo)致動(dòng)物死亡[9]。尤其在負(fù)壓生物安全實(shí)驗(yàn)室中，由于實(shí)驗(yàn)操作人員對(duì)乙醚敏感性不同，如果操作的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量過多，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)人員的不適，并且乙醚具有易燃、易爆等特性，目前已不推薦使用[9,10]。巴比妥類藥物中最常用的是戊巴比妥鈉。戊巴比妥鈉是一種鎮(zhèn)靜催眠藥，大劑量使用可產(chǎn)生麻醉作用，對(duì)呼吸中樞抑制作用較強(qiáng)，安全范圍較小，麻醉過量易導(dǎo)致動(dòng)物死亡[9]。隨著我國(guó)對(duì)毒麻藥的管控越來越嚴(yán)格，戊巴比妥鈉不易在市場(chǎng)上購(gòu)買。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠家無藥物級(jí)的戊巴比妥鈉，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)只能使用化學(xué)級(jí)的戊巴比妥鈉。若使用藥物級(jí)的戊巴比妥鈉，只能從國(guó)外進(jìn)口，但是又存在進(jìn)口周期長(zhǎng)以及關(guān)稅、價(jià)格高等諸多問題。過去，采用水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉也是一種常用的麻醉方法，水合氯醛對(duì)心血管功能影響小[9]。目前認(rèn)為水合氯醛適合于催眠而非麻醉，水合氯醛會(huì)導(dǎo)致顯著的呼吸抑制，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有致突變和致癌作用[9,11]。2009年麻醉學(xué)雜志(Anesthiology)就不再發(fā)表使用水合氯醛進(jìn)行麻醉或施行安死術(shù)的文章[9]。目前，異氟烷是一種廣泛使用的吸入性麻醉劑，無色透明，不易燃不易爆，麻醉誘導(dǎo)和恢復(fù)快，體內(nèi)代謝少。采用異氟烷麻醉對(duì)腦、肝臟、腎臟無不良影響; 維持麻醉時(shí)動(dòng)物的心率、血氧分壓、血液pH等生理功能穩(wěn)定; 深度麻醉時(shí)，引起呼吸抑制[9,12]。值得注意的是，兔和龜類會(huì)閉氣并產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，應(yīng)避免使用異氟烷等對(duì)兔和龜類進(jìn)行氣體誘導(dǎo)麻醉; 在誘導(dǎo)麻醉后, 異氟烷可迅速且顯著抑制雪貂血液學(xué)參數(shù)[13]。七氟烷無色透明, 不易燃不易爆, 對(duì)呼吸系統(tǒng)刺激小,七氟烷麻醉時(shí)誘導(dǎo)期短, 麻醉維持期平穩(wěn)，蘇醒快，是一種理想的吸入麻醉劑。異氟烷和七氟烷等新型吸入性麻醉劑操作簡(jiǎn)單、安全, 可快速誘導(dǎo)麻醉, 蘇醒快。因此, 作者建議在滴鼻和動(dòng)物手術(shù)等操作過程中根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的麻醉劑, 在不影響實(shí)驗(yàn)的前提下, 盡量使用異氟烷等進(jìn)行麻醉[12]。

如果將文章中使用的麻醉劑分為注射性麻醉劑和吸入性麻醉劑, 使用注射性麻醉劑和吸入性麻醉劑的比例分別為40.6%(101/249)和59.4%(148/249)。使用注射性麻醉劑具有價(jià)格便宜、操作技術(shù)簡(jiǎn)單、麻醉持續(xù)周期不長(zhǎng)，操作不復(fù)雜等優(yōu)點(diǎn)，但也有易麻醉過度、單次注射不易把握麻醉深度、麻醉藥受管控、麻醉起效慢、麻醉恢復(fù)慢等缺點(diǎn)。采用吸入性麻醉劑具有麻醉起效快、麻醉恢復(fù)快、容易掌握麻醉深度、麻醉藥在動(dòng)物體內(nèi)新陳代謝少等優(yōu)點(diǎn), 但也有吸入性麻醉機(jī)價(jià)格昂貴、操作人員需要經(jīng)過培訓(xùn)才能進(jìn)行操作、動(dòng)物呼出的麻醉氣體需要回收等缺點(diǎn)[14]。在國(guó)外的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中, 常用的注射性麻醉劑為戊巴比妥鈉、丙泊酚、氯胺酮和賽拉嗪復(fù)合麻醉、氯胺酮和右美托咪定復(fù)合麻醉、氯胺酮和賽拉嗪以及乙酰丙嗪復(fù)合麻醉; 常用的吸入性麻醉劑為異氟烷和七氟烷[14]。需要注意的是動(dòng)物的存活實(shí)驗(yàn)一般不使用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉[14]。鑒于動(dòng)物的倫理福利日益受到關(guān)注，在進(jìn)行滴鼻實(shí)驗(yàn)時(shí)建議不要使用戊巴比妥鈉進(jìn)行動(dòng)物的麻醉。

英國(guó)3Rs中心(Nation Centre for the Replacement Refinement & Reduction of Animals in Research,N C 3 R s)發(fā)布了《動(dòng)物研究: 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)告(ARRIVE)》指南[15]。ARRIVE指南明確指出, 撰寫論文對(duì)涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理聲明、動(dòng)物的基本信息(品種、品系、年齡、來源等)以及實(shí)驗(yàn)操作的順序、步驟等都要詳細(xì)論述。調(diào)查表明, 33.4%(257/770)的文章未提到小鼠的滴鼻劑量。提到小鼠滴鼻劑量的513文章中，有49.3%(253/513)的文章未提及進(jìn)行滴鼻時(shí)是否使用麻醉。目前很多國(guó)際雜志(如PLoS One[16])在投稿指南中, 鼓勵(lì)研究人員按照ARRIVE指南撰寫論文, 確保動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到充分利用[17,18]。從2016年開始, 《中國(guó)組織工程研究》雜志提出投稿的論文按照ARRIVE指南撰寫[18,19]。作者認(rèn)為國(guó)內(nèi)的中文學(xué)術(shù)期刊也應(yīng)對(duì)投稿的論文加以要求，以提高動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)告的水平。