楊燕燕, 謝金東, 周建華, 林 瑋, 王訓(xùn)立

(福建中醫(yī)藥大學(xué), 福州 350122)

近年來(lái)研究[1,2]表明, 靈芝多糖(GLPs)為靈芝的主要有效活性成分, 具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、血脂溶度調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管功能及抑制血小板凝集、抗血栓形成等作用, 然而它在脂多糖(LPS)-Toll樣受體4(TLR4)這一重要信號(hào)環(huán)節(jié)的分子作用機(jī)制尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。LPS是炎癥性疾病的最主要原因之一[3]。TLR4負(fù)責(zé)LPS的識(shí)別，TLR4與LPS結(jié)合后，經(jīng)TLR4-髓樣分化因子88(MyD88)途徑激活核因子-κB(NF-κB)是啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)炎癥及天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的經(jīng)典途徑[4]。本課題組前期研究表明，GLPs可顯著減少動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等炎癥因子的表達(dá)[5]。

因此, 本實(shí)驗(yàn)擬采用LPS作用RAW264.7巨噬細(xì)胞株模擬外源性抗原刺激, 觀察不同劑量GLPs藥物對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，以進(jìn)一步探討其抗炎作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，通過(guò)Abelson鼠白血病病毒誘導(dǎo)BALB/c小鼠致腫瘤后收集腹水取得，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與主要儀器

無(wú)支原體胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司; 100×青鏈霉素混合液、二甲基亞砜(DMSO, 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)等購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司; GLPs購(gòu)自杭州眾芝康菇生物科技有限公司; LPS(E.coliO55:B5)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司; Anti-TLR4 antibody、Anti-MyD88 antibody、Anti-NF-κB antibody、Anti-TNF-α antibody等均購(gòu)自美國(guó)CST公司; Anti-(腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6, TRAF-6) antibody、Anti-LOX-1 antibody等均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司; Anti-β-Actin Mouse Monoclonal antibody購(gòu)自Trans公司; Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP Antibody和Pierce Goat Anti-Rabbit IgG-HRP Antibody均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

2720 PCR擴(kuò)增儀，Stepone Plus型熒光定量PCR儀均購(gòu)自美國(guó)ABI公司; DYY-6C電泳儀購(gòu)自北京六一公司; Mini-PROTEAN@ Tetra小型垂直電泳槽、Power Pac電泳儀和 ChemiDoc XRS +凝膠成像分析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Biorad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組實(shí)驗(yàn)

RAW264.7細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng), 6孔培養(yǎng)板接種, 放置于37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對(duì)濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn), 隨機(jī)分為5組，每組9個(gè)重復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組不做處理; LPS組用終濃度l μg/mL LPS的10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h; 其他治療組加入含有40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL等低、中、高劑量的GLPs含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h, 再加入 LPS(終濃度 l μg/mL)刺激 16 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞。

1.4 Real-time PCR法分析

基因序列從GenBank獲取，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Trizol法提取RAW264.7細(xì)胞總RNA，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系得到cDNA。PCR反應(yīng)總體系20.0 μL: 2×SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL，Template cDNA 2.0 μL，10 μmol/L PCR Forward Primer 0.4 μL，10 μmol/L PCR Reverse Primer 0.4 μL, ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為 95 ℃ 3 min, 95 ℃ 7 s，55 ℃ 10 s, 72 ℃ 15 s,共45個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)計(jì)算依據(jù)2-ΔΔCT法[6]。

1.5 Western blotting分析

PMSF裂解細(xì)胞，收集蛋白樣品，采用BCA方法定量蛋白濃度后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白/泳道上樣，SDS-PAGE垂直板全濕法電泳; 轉(zhuǎn)于PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次10 min; 加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，洗滌后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色; 經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)分析目標(biāo)條帶。

表 1 各基因的引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析, 數(shù)據(jù)以x- ±s表示; 組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取及降解狀況

如圖1所示, 細(xì)胞總RNA條帶的18 S、28 S條帶清晰完整，表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中RNA抽提效果較好，基本無(wú)降解。

2.2 TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)途徑

與對(duì)照組相比, LPS組TLR4、MyD88、NF-κB和TRAF-6 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。與LPS組相比，經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組TLR4、MyD88、NF-κB和TRAF-6 mRNA表達(dá)均有不同程序的降低,且GLPs中、高劑量組TLR4、MyD88、TRAF-6 mRNA及GLPs低、中、高劑量組NF-κB mRNA均具有顯著性差異(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。Western blot結(jié)果表明, LPS組TLR4、MyD88、NF-κB和TRAF-6蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組, GLPs干預(yù)能夠下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB 和 TRAF-6 的蛋白水平(圖 2), 與mRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

圖 1 RNA檢測(cè)電泳結(jié)果

表 2 各組TLR4、MyD88、NF-κB和TRAF-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

圖 2 各組TLR4、MyD88、NF-κB和TRAF-6蛋白的表達(dá)

2.3 TNF-α及LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，LPS組TNF-α、LOX-1 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。與LPS組相比，經(jīng)GLPs干預(yù)后各劑量組TNF-α、LOX-1 mRNA表達(dá)均有不同程序的降低，并差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3)。Western blotting結(jié)果表明, LPS 組TNF-α、LOX-1蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，GLPs干預(yù)能夠下調(diào)TNF-α、LOX-1蛋白水平(圖3)，與mRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

表 3 各組TNF-α、LOX-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

圖 3 各組TNF-α、LOX-1蛋白的表達(dá)

3 討論

中藥多糖通過(guò)與細(xì)胞上相應(yīng)受體的相互作用發(fā)揮生物活性，巨噬細(xì)胞作為宿主抵抗微生物病原體的首要防線，發(fā)現(xiàn)并研究其表面藥物受體及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)揭示中藥多糖免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用機(jī)制具有重要作用。近年來(lái)，陸續(xù)有研究[7,8]表明，部分中藥多糖免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用與TLR4有關(guān)，而本文關(guān)于GLPs影響LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路過(guò)度激活的研究具有創(chuàng)新性。

LPS作為炎性刺激因子, 可與髓樣分化蛋白-2結(jié)合形成緊密復(fù)合物, 促使TLR4激活[9]。巨噬細(xì)胞表面TLRs/TLR4是一種重要的炎癥信號(hào)傳遞門戶蛋白, 能夠作為模式識(shí)別受體識(shí)別特定類型微生物的保守分子成分。TLR4受體激動(dòng)后, 可經(jīng)由MyD88依賴途徑主導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)通路激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)。接頭蛋白MyD88募集并激活TRAF-6, 隨后在活化TAK1的基礎(chǔ)上激活I(lǐng)KK(IκB kinasa)和NF-κB,啟動(dòng)炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因及干擾素誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)[10,11]。本研究表明,LPS配體刺激巨噬細(xì)胞后TLR4激活, 下游MyD88依賴通路主要反應(yīng)因子MyD88、NF-κB和TRAF-6均顯著升高。GLPs藥物干預(yù)后，TLR4、MyD88、NF-κB和TRAF-6等指標(biāo)均顯著降低。GLPs對(duì)TLR4信號(hào)通路的上述作用被阻斷，推測(cè)GLPs在此通路的作用機(jī)制可能與TLR4-MyD88-NF-κB途徑有關(guān)。

TNF-α作為炎癥介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子，具有活化內(nèi)皮細(xì)胞，趨化中性粒細(xì)胞的重要作用;可以直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，還可以通過(guò)促進(jìn)黏附分子的表達(dá)來(lái)加快細(xì)胞黏附及遷移[12]。與此同時(shí)，TLR4信號(hào)通路下游炎癥因子LOX-l作為氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的特異性受體，可以促進(jìn)脂質(zhì)氧化, 在誘導(dǎo)NF-κB活化的基礎(chǔ)上加速由ox-LDL誘導(dǎo)的黏附分子和炎性因子的表達(dá); 其本身也可作為內(nèi)皮黏附分子，作用于活化的血小板, 促進(jìn)ox-LDL和細(xì)胞于血管壁富集[13]。而LPS刺激的巨噬細(xì)胞可通過(guò)TLR4/NF-κB途徑上調(diào)TNF-α、LOX-1等因素的表達(dá), 進(jìn)一步啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS刺激的巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α、LOX-1表達(dá)顯著升高。采用GLPs干預(yù)后，TNF-α、LOX-1水平相較于LPS組均明顯下降，因此，推測(cè)GLPs通過(guò)抑制TNF-α、LOX-1等炎性因子的表達(dá)和釋放，減少組織損傷和炎癥反應(yīng)。

本研究中GLPs治療組以高劑量組效果較為顯著，但由于GLPs空間構(gòu)型復(fù)雜，本身即具有雙向調(diào)節(jié)作用; 同時(shí)多糖一般通過(guò)多途徑、多層面、多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路對(duì)機(jī)體發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[14-16]。因此，除了TLRs/TLR4之外，還可對(duì)各種細(xì)胞表面模式識(shí)別受體的相互拮抗或協(xié)同調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更深層次的研究。