杜小燕, 陳柏安, 仵 毅, 郭 萌

(首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部, 北京 100069)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在全球飛速進(jìn)步，尤其是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域取得巨大成就并得到廣泛應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造動(dòng)物性狀后獲得的一類珍貴的動(dòng)物資源，通過實(shí)驗(yàn)手段將新的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到動(dòng)物胚細(xì)胞中，并能穩(wěn)定遺傳，由此獲得的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[1]。自從1980年Gorden完善了顯微注射技術(shù)[2]和1982年第一只超級(jí)小鼠問世以來[3]，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(基因修飾動(dòng)物)作為人類疾病動(dòng)物模型開始進(jìn)入了醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)基因(基因修飾)動(dòng)物及技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的作用越來越顯著，應(yīng)用也越來越廣泛，新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9更被看作下一個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)的熱門[4,5]。因此，讓醫(yī)學(xué)院校的研究生了解和掌握轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域的前沿技術(shù)和發(fā)展動(dòng)態(tài)，初步掌握轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法與技能，將會(huì)為其以后的研究工作增加理論和技術(shù)儲(chǔ)備。首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部面向全校(包括校本部和臨床醫(yī)院)開設(shè)了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)這門課程，上課后學(xué)生的反響非常好，在此分享開設(shè)該課程的體會(huì)。

1 針對(duì)醫(yī)學(xué)研究生開設(shè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)課程的意義

轉(zhuǎn)基因(基因修飾)動(dòng)物自誕生伊始就和醫(yī)學(xué)緊密相連，可以說醫(yī)學(xué)研究離不開轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。從轉(zhuǎn)基因技術(shù)誕生到現(xiàn)在歷經(jīng)30多年，經(jīng)過不斷發(fā)展和完善，尤其CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)后表現(xiàn)得非常經(jīng)濟(jì)和高效，越來越多的生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室擁有了自己的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備平臺(tái)。

目前世界各地研發(fā)的基因工程品系僅小鼠和大鼠已接近20 000種[6]。在PubMed中查詢表明，利用基因修飾小鼠進(jìn)行研究的論文達(dá)41萬多篇。我們統(tǒng)計(jì)了自1983年超級(jí)小鼠問世以來含有Knockout mouse和Transgenic mouse的論文，顯示論文數(shù)量與發(fā)表時(shí)間具有正相關(guān)性(圖1)，但從2016年開始有下降趨勢(shì)，其原因可能是CRISPR/Cas9等新型基因編輯技術(shù)突破了基因敲除局限于小鼠胚胎干細(xì)胞操作的瓶頸，除小鼠以外的其他動(dòng)物包括大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因修飾研究日新月異，從圖2我們可以看出，大鼠、兔、豬、非人靈長(zhǎng)類等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究論文在PubMed中合計(jì)達(dá)到23 441篇，這些數(shù)據(jù)顯示基因修飾動(dòng)物在科學(xué)研究的影響力之大和使用范圍之廣，也充分說明CRISPR/Cas9技術(shù)使更多類型的動(dòng)物基因敲除成為可能，近5年更是有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

在醫(yī)學(xué)研究中, 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的意義體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。首先, 在疾病治療方面，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究基因治療是重要突破點(diǎn)。1980年代初，科學(xué)家首次利用原核顯微注射技術(shù)成功將生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入小鼠，獲得了個(gè)體幾乎可以和大鼠“媲美”的超級(jí)小鼠，預(yù)示有了治療人類侏儒癥的希望，也由此為基因治療帶來了生機(jī)，科學(xué)家們開始了基因治療的探索。最近，科學(xué)家們用CRISPR/Cas9 技術(shù)制備的質(zhì)粒結(jié)合人造病毒來研究用基因敲除技術(shù)治療肝癌[7]; 人們正在試圖用基因修飾的豬胰島進(jìn)行異源性移植來治療糖尿病的可行性[8]; 科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯β-球蛋白來治療鐮刀血病[9]。第二，多種重大疾病的發(fā)病機(jī)制、靶點(diǎn)篩選和藥物評(píng)價(jià)等研究離不開轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。例如: 感染性疾病艾滋病、乙型肝炎等, 退行性神經(jīng)疾病阿爾茨海默癥、亨廷頓氏病等, 多種類型腫瘤，精神病抑郁癥等，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，科學(xué)家們已制備出越來越多種能夠較好復(fù)制人類疾病的動(dòng)物模型和人源化動(dòng)物模型, 如將1.3個(gè)拷貝的乙型肝炎病毒插入到小鼠基因組，使動(dòng)物肝臟表達(dá)病毒, 獲得小鼠乙型肝炎模型[10]。將人類突變的亨廷頓基因轉(zhuǎn)入非人靈長(zhǎng)類獲得了亨廷頓氏病動(dòng)物，模型具有人類亨廷頓氏病的典型臨床表型[11]。最近我國科學(xué)家又將自閉癥相關(guān)基因MECP2轉(zhuǎn)入猴基因組，建立了第一種轉(zhuǎn)基因猴自閉癥模型，轉(zhuǎn)基因猴具有人類自閉癥的臨床表現(xiàn)[12]。其他例如將人類PD-1、CTLA4等基因通過同源重組方法取代小鼠基因獲得的人源化小鼠廣泛應(yīng)用于腫瘤治療、抗體和免疫調(diào)節(jié)劑藥物篩選及評(píng)估的研究，利用APOE敲除小鼠制備的動(dòng)脈粥樣硬化模型，app、ps1、tau等不同突變或聯(lián)合突變轉(zhuǎn)基因大小鼠阿爾茨海默癥模型，多種基因敲除免疫缺陷小鼠等方面的研究更是不勝枚舉。由此可見，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的有力武器。

圖 1 基因敲除小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠和基因修飾小鼠

2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)課程教學(xué)體會(huì)

圖 2 利用除小鼠外的其他主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在PubMed中發(fā)表文章的數(shù)量

2.1 教材建設(shè)

雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)課程在首都醫(yī)科大學(xué)開設(shè)已有十余年，但一直都采用教師自行收集材料編寫成冊(cè)作為教學(xué)材料使用，缺乏面向?qū)W生尤其是研究生的教材。2011年我們啟動(dòng)了教材編寫工作, 在前任教師們編寫手稿的基礎(chǔ)上, 參考了Robert F. Weaver的《分子生物學(xué)》、卡爾的《轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)手冊(cè)》等專著，查閱了近200篇外文文獻(xiàn)，增加了大量較新的技術(shù)內(nèi)容, 例如CRISPR/Cas9和TALEN[transcription activator-like (TAL) effector nucleases]等，于2013年命名為《基因修飾小鼠制備常用技術(shù)》，完成了醫(yī)學(xué)院校轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)課程的教材建設(shè)。在該教材中，以小鼠為主要對(duì)象，系統(tǒng)闡述了基因修飾動(dòng)物概述、原核注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除小鼠制備、條件性基因敲除、基因捕獲、CRISPR/Cas9和TALEN系統(tǒng)敲除以及基因修飾小鼠繁育和保種等7個(gè)章節(jié)的內(nèi)容，這些內(nèi)容既方便學(xué)習(xí)和使用基因修飾小鼠的醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所及相關(guān)科研人員，也基本做到了對(duì)國際上最新開發(fā)的基因修飾技術(shù)方法的兼收并蓄[13]。

2.2 課程大綱和內(nèi)容設(shè)置

在教學(xué)大綱中，我們確定的教學(xué)目標(biāo)為“通過本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生了解和掌握轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域的前沿技術(shù)和發(fā)展動(dòng)態(tài)，初步掌握轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法與技能，為以后的研究工作增加理論和技術(shù)儲(chǔ)備”。為了實(shí)現(xiàn)這樣的目的，我們采用“理論授課、實(shí)驗(yàn)教學(xué)以及視頻錄像相結(jié)合的方法。使用現(xiàn)代教學(xué)手段方面的要求：多媒體教學(xué)所需設(shè)備儀器以及VCD、錄像帶等”的教學(xué)方法。

該課程共28學(xué)時(shí)，其中理論課10學(xué)時(shí)，主要介紹轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本知識(shí)、研究進(jìn)展、應(yīng)用領(lǐng)域及研究中存在的問題；實(shí)驗(yàn)課18學(xué)時(shí)分5次教學(xué)，以顯微注射法為例學(xué)習(xí)和練習(xí)轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，包括小鼠的超數(shù)排卵、假孕鼠的制備、胚胎收集鑒定、外源基因?qū)?、胚胎移植及胚胎冷凍保存等?nèi)容。這樣的課程設(shè)計(jì)，能讓研究生既學(xué)習(xí)了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念、命名、原理等基本知識(shí)，也擴(kuò)展了他們的知識(shí)面，擴(kuò)大視野，了解了顯微注射方法[2]等傳統(tǒng)技術(shù)，同時(shí)接觸到鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技術(shù)[14]、TALEN 靶向基因敲除技術(shù)[15]、CRISPR/Cas9技術(shù)[5]以及這些技術(shù)的優(yōu)勢(shì)所在[16]。例如在理論課程中，我們介紹TALAN以及CRISPR/Cas9兩種技術(shù)，講解原理和制備方法，并檢索大量應(yīng)用這些技術(shù)的文獻(xiàn)，分析其研究思路。我們還介紹了最新出現(xiàn)的NgAgo(Natronobacterium gregoryiArgonaute) 技術(shù)(DNA作為引導(dǎo)工具的基因編輯技術(shù))及與之相關(guān)的爭(zhēng)議[17]，力圖將科研誠信教育和科研新思路相結(jié)合。為了讓學(xué)生有更深刻的印象和豐富實(shí)踐，我們充分利用動(dòng)物部實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)課優(yōu)勢(shì)的學(xué)時(shí)分配方案，在實(shí)驗(yàn)中學(xué)生能從超數(shù)排卵到顯微注射法全程進(jìn)行操作。學(xué)生課后都感慨這些操作非常實(shí)用和精細(xì)，獲益匪淺。

2.3 課程考核方法改革

作為研究生選修課的考核，我們摒棄了過去出題考試或者寫綜述的考試方法，而是利用小班課優(yōu)勢(shì)，讓每個(gè)研究生根據(jù)自己的專業(yè)，按擬定的研究方向或研究?jī)?nèi)容等查閱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用方面的文獻(xiàn)，從文獻(xiàn)的研究背景、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備思路、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在整個(gè)研究中的作用、研究結(jié)果、有哪些缺陷、如何評(píng)價(jià)其作用等方面借助PPT進(jìn)行講述。在設(shè)計(jì)初始，我們擔(dān)心這種改革可能對(duì)于涉入科研尚淺的研究生會(huì)有困難，但最終教學(xué)效果出乎意料地好，同學(xué)們不但完成了老師的“規(guī)定動(dòng)作”，有的還加入多篇同一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在該領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)行比較。例如一位骨科專業(yè)的學(xué)生，以1篇文章為切入點(diǎn)，將本領(lǐng)域中對(duì)骨密度相關(guān)基因研究的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及其應(yīng)用進(jìn)行了分析和比較，深入淺出地講述讓同學(xué)們聽得入迷。這種改革不但幫助學(xué)生掌握理論知識(shí)，了解本領(lǐng)域新進(jìn)展，還通過交流激發(fā)了對(duì)其他方向的濃厚興趣，為學(xué)生與學(xué)生、教師與學(xué)生之間建立聯(lián)系和研究交叉提供了非常好的機(jī)會(huì)。

雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)中發(fā)揮重要作用,基因編輯技術(shù)業(yè)已成為生命科學(xué)研究中的常用技術(shù)手段之一, 但是很多醫(yī)學(xué)院校的教師和學(xué)生都存在認(rèn)識(shí)誤區(qū), 甚至有些臨床醫(yī)學(xué)科研人員和研究生認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與自己的科研沒有關(guān)系。所以盡管上課效果和反響不錯(cuò), 但我們的課程選修人數(shù)卻不太多。

因此, 我們建議醫(yī)學(xué)院校首先應(yīng)擴(kuò)大宣傳，讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到這一技術(shù)的重要性。作為將來要從事臨床或基礎(chǔ)研究的醫(yī)學(xué)院校研究生，其研究生涯中可能涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。那么, 醫(yī)學(xué)研究生們能夠?qū)Σ煌D(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)以及進(jìn)展進(jìn)行了解和學(xué)習(xí), 對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的命名、繁育、鑒定、保種等知識(shí)的了解是非常必要的。第二, 我們還建議在課程中多介紹最新的進(jìn)展以引起學(xué)生的重視和興趣, 例如在教學(xué)中每年更新圖1和圖2的數(shù)據(jù), 以此凸顯該課程的重要性。2017年我們?cè)诮虒W(xué)中介紹了Nature Communication雜志的最新論文[18],學(xué)生表現(xiàn)出極大興趣。希望更多醫(yī)學(xué)院校能通過本文的闡述了解開設(shè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物課程的意義和教學(xué)實(shí)踐，為研究生開設(shè)這門課程。