劉韶娜，趙智勇，張 斌，相德才，趙彥光

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224）

1 豬精液冷凍保存技術(shù)的進(jìn)程

隨著人工授精技術(shù)的推廣和應(yīng)用，豬的精液保存技術(shù)也逐漸發(fā)展，并日益受到關(guān)注。1787 年，意大利科學(xué)家Spallazani 首次對人和馬的精液在-17 ℃下進(jìn)行冷凍保存并發(fā)現(xiàn)有少數(shù)精子存活[1]，Luget和 Hodepp 研究發(fā)現(xiàn)-192 ℃條件下人的精子冷凍保存后仍舊有少數(shù)精子存活[2]，從而打開了精子冷凍保存的新篇章。1949 年，英國科學(xué)家Polge 等發(fā)現(xiàn)，甘油對牛的精子冷凍保存具有一定的保護(hù)作用，1970年第一次報(bào)導(dǎo)有人使用凍融后豬精液進(jìn)行人工輸精獲得83%受精卵，成功使用凍精進(jìn)行人工授精的仔豬生產(chǎn)，更加充分地證實(shí)了豬精子凍融后仍具有受精能力的觀點(diǎn)[3-4]。我國從20 世紀(jì)70 年代開始液氮凍精技術(shù)的研究，20 世紀(jì)90 年代開始凍精技術(shù)逐漸開始由顆粒型轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)管型[5]。近年來的研究顯示豬精子冷凍保存精子存活率可達(dá)0.5 以上[6-8]。陳明明等研究優(yōu)化精子基礎(chǔ)稀釋液、甘油濃度和解凍條件發(fā)現(xiàn)-80 ℃條件下，精子冷凍后活力可達(dá)到0.57[9]。查星琴[10]等對版納微型豬近交系種公豬精液冷凍保存條件研究發(fā)現(xiàn)2%和3%的甘油對豬的精液均有良好的保護(hù)作用，而50 ℃ 6 s 和40 ℃ 6 s 的水浴解凍條件下精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率均最高。隨著科技的不斷進(jìn)步，豬的精液冷凍保存技術(shù)也越來越先進(jìn)，在豬的生產(chǎn)中也得到了越來越多的使用。精液冷凍保存技術(shù)在奶牛生產(chǎn)中得到了全面的應(yīng)用，但在豬的繁殖和品種改良方面運(yùn)用率還較低，還需進(jìn)一步研究[11]。因此，本研究擬從豬精液冷凍保存技術(shù)影響因素和存在問題等方面進(jìn)行綜述，為豬的精子冷凍保存技術(shù)研究提供理論依據(jù)、為進(jìn)一步提高豬的精子冷凍保存技術(shù)，提高種豬生產(chǎn)性能而提供理論支持。

2 豬精液冷凍保存技術(shù)的影響因素

豬的精液冷凍保存一般采用顆粒保存、細(xì)管保存和扁平塑料袋保存3 種，生產(chǎn)實(shí)際最常用的是細(xì)管保存。精液冷凍保存的流程為：精液的質(zhì)量檢測、精液冷凍和精液解凍3 步。

2.1 精液的質(zhì)量檢測

精液的檢測一般通過外觀和顯微鏡檢測兩方面。外觀檢測一般通過顏色、氣味、采精量和質(zhì)地等幾方面綜合檢測。一般豬的精液呈現(xiàn)出乳白色或者淺灰色，質(zhì)地均勻無水乳分離現(xiàn)象，氣味為略微腥味無腥臭或者惡臭味，一次容量為300 ～500 mL[5]。

精子的顯微觀察包括活率、密度和形態(tài)[11-12]。精子活率通常采用十級評分法評定，一般提前37 ℃預(yù)熱，用BST 液稀釋后，在400×倒置顯微鏡下觀察。豬的精子密度一般為2 ～3 億/mL，通常使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法來估算，一般通過稀釋后在40×顯微鏡下觀察[13]。形態(tài)觀察則通過頂體完整率和精子畸形率來評定。一般精子畸形率應(yīng)該低于18%[14]。

2.2 精液的稀釋液和冷凍保護(hù)液

豬的精液稀釋液主要成分包括：低密度脂蛋白、膽固醇、冷凍保存劑、多糖、抗氧化劑和緩沖液等[10,15-19]。當(dāng)精液溫度低于0 ℃后，會(huì)形成冰晶，細(xì)胞外產(chǎn)生冰晶，使得稀釋液的滲透壓發(fā)生變化，促使細(xì)胞產(chǎn)生滲透脅迫，而冷凍保護(hù)劑可以提高滲透壓，使細(xì)胞通過滲透脫水，防止冰晶的產(chǎn)生，從而保護(hù)精子[20]。在冷凍稀釋液中添加芝麻酚和番茄紅素均能提高精液冷凍質(zhì)量，能夠提高解凍后的精液品質(zhì)，而黃芩素則能在精液解凍過程中起保護(hù)作用[21]。糖類為非滲透性保護(hù)劑，常用作稀釋液成分的有葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇等，能夠提供能量維持代謝，如葡萄糖能夠通過精子的質(zhì)膜，利用糖酵解或三羧酸循環(huán)而給精子提供一定的能量[21]。姜澤研究發(fā)現(xiàn)添加2 mg/mL 的甘露醇能顯著提高冷凍后精子的質(zhì)膜完整率，可以緩解低溫對精子活率、質(zhì)膜及頂體完整性的損傷，減少精子凋亡基因的表達(dá)量，緩解精子的凋亡程度，從而提高受精率[21]。馬紅通過在民豬精液冷凍稀釋液中添加0.15 mol/L 的海藻糖后發(fā)現(xiàn)均能提高精子活率、線粒體膜電位、頂體完整率和質(zhì)膜完整率[17]。此外，各種單糖和多糖類，如葡萄糖、黃芪多糖、紅景天多糖等均對精子冷凍有保護(hù)作用[23-27]。冷凍保護(hù)劑類常用的有甘油，卵黃等。其中甘油是目前豬的精液冷凍保存中最常見的成分之一[19]。卵黃在冷凍保護(hù)中主要有效成分為低密度脂蛋白，通過其粘附在精子的細(xì)胞膜上，在低溫刺激的時(shí)候形成一種凝膠化狀態(tài)的物質(zhì)，同時(shí)精子膜上的部分磷脂被取代，降低精子膜溫度的轉(zhuǎn)變；可以與蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，以此來阻止精子膜磷脂和膽固醇的外流，不同來源的卵黃由于各成分比例不同而保護(hù)的效果有差異。曹立鵬等發(fā)現(xiàn)添加9%鴿蛋來源的低密度脂蛋白對豬精子冷凍保存具有保護(hù)作用，解凍后精子活力特征顯著高于其他組[26]。HU 等發(fā)現(xiàn)添加9%雞蛋來源的低密度脂蛋白能顯著提高豬精液冷凍保存的質(zhì)量[27]。Bathgate則認(rèn)為雞蛋和鴨蛋來源的低密度脂蛋白對豬精子冷凍保存效果要優(yōu)于鵪鶉蛋[28]?？寡趸瘎╊愔饕謨煞N，一類是酶類抗氧化劑，如：谷胱甘肽過氧化物酶和SOD 等；一類是非酶類抗氧化劑，如：谷胱甘肽、維生素C、維生素E、青花素等。抗氧化劑的主要作用是通過與精子呼吸代謝產(chǎn)物-活性氧結(jié)合，降低精子細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸氧化，保護(hù)了精子結(jié)構(gòu)的完整性[29]。孫燕青研究發(fā)現(xiàn)40 ug/mL 的葡萄籽原青花素能顯著降低豬冷凍精液解凍后的畸形率，并顯著提高精子活率和線粒體活性[30]。李世佳通過白藜蘆醇對人的冷凍精子影響研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能降低冷凍損傷，改善冷凍后的精子質(zhì)量和功能[31]。霍敏則認(rèn)為輔酶Q 可以提高冷凍后的絨山羊精子質(zhì)量[32]。

豬的精液冷凍劑型常見的有顆粒凍精、細(xì)管凍精和扁平塑料袋凍精。顆粒凍精常用一次稀釋法制得，即將精液與稀釋液按一定比例稀釋后直接冷凍。扁平塑料袋精液常用兩次稀釋法制得，即將精液與第一稀釋液按比例混合后，再與第二稀釋液按比例混合后冷凍。細(xì)管保存一般分為0.25 mL 和0.50 mL，薛琦[33]研究豬精液冷凍保存后認(rèn)為，-80 ℃冷凍保存時(shí)，兩者無顯著差異，-196 ℃冷凍保存時(shí)，0.50 mL細(xì)管凍精的冷凍效果明顯優(yōu)于0.25 mL。細(xì)管凍精也是實(shí)際生產(chǎn)中使用頻率最高的一種凍精劑型，其具有冷卻迅速，不易污染、使用方便和受胎率高的特點(diǎn)。

2.3 精液的冷凍

豬的精子對溫度的下降速度非常敏感，溫度的變化會(huì)影響部分蛋白的功能。當(dāng)溫度不高于15 ℃的時(shí)候，就會(huì)造成對精子的質(zhì)膜損傷，精子細(xì)胞內(nèi)容物向外流失，精子活率開始下降[34]。Althouse 則認(rèn)為豬的精子臨界溫度是12 ℃[35]。當(dāng)溫度不高于5 ℃的時(shí)候，則影響Ca2+穩(wěn)定狀態(tài)、頂體及膜脂質(zhì)完整性[36]，同時(shí)精子細(xì)胞膜上脂質(zhì)分離，釋放膽固醇，影響脂質(zhì)和蛋白質(zhì)間的相互作用[37]。所有的這些變化會(huì)影響某些蛋白質(zhì)的功能。精子的冷凍保存一般是指-196 ℃的超低溫液氮保存，在此溫度條件下，精子進(jìn)入玻璃化溫度區(qū)，即精子膜兩側(cè)的液體同時(shí)固化為玻璃樣固體，水分子形成堅(jiān)硬均質(zhì)的冰結(jié)，精子膜能維持正常構(gòu)造，細(xì)胞不會(huì)脫水，所有細(xì)胞活動(dòng)都會(huì)完全停止，因此理論上講超低溫冷凍精液可以無限期保存。0 ～-60 ℃是有害冰晶區(qū)，精子處于冰晶區(qū)的時(shí)間長短與冰晶大小成正比，對精子的損害也成正比，豬的精子冷凍過程中應(yīng)該縮短在冰晶區(qū)的時(shí)間。

精液的冷凍方法一般包括程序冷凍法和液氮熏蒸法。程序冷凍法是通過控制液氮?dú)饣乃俾蕘砜刂平禍氐乃俾?，能夠監(jiān)控到溫度的變化，但對儀器要求較高。液氮熏蒸法則是直接投放于液氮當(dāng)中，迅速制冷，對儀器要求較低，操作簡單，但降溫速率不可控制。吳衍等研究發(fā)現(xiàn)程序冷凍法處理犬精液后精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率較高，冷凍效果優(yōu)于液氮熏蒸法[38]，這是由于液氮熏蒸法依靠冷凍支架及細(xì)管離液氮面的距離來控制降溫速率的，其受到影響因素大[39]。

2.4 冷凍精子的解凍

冷凍精子的解凍溫度一般分為0 ～5 ℃、30 ～40 ℃（一般為37 ℃）和50 ～70 ℃。不同的溫度對應(yīng)的解凍時(shí)間也不一致。鄭筱峰通過研究姜曲海豬冷凍精液的解凍條件發(fā)現(xiàn)，液氮中取出的冷凍精液37 ℃水浴后精子質(zhì)量明顯優(yōu)于放置室溫后37 ℃水浴[40]。高小莉則認(rèn)為50 ℃為雞的冷凍精液解凍的最佳溫度[41]。凌培鳳發(fā)現(xiàn)豬冷凍精液的最佳解凍溫度為37 ℃ 30 s 和65 ℃ 5 s[42]。解凍時(shí)升溫速度過快則造成精子內(nèi)外滲透壓不一致，能損壞細(xì)胞膜，而升溫速度過慢細(xì)胞外液已形成冰晶。

冷凍精子的解凍方式分為干法解凍和濕法解凍。干法解凍是將解凍后的精子放入二氧化碳培養(yǎng)箱中撫育，濕法解凍是指將精子放到恒溫水浴鍋中。如果凍精封口不嚴(yán)，濕法解凍則會(huì)造成一定的應(yīng)激。

3 豬精液冷凍保存技術(shù)存在的問題

3.1 對冷凍精液的設(shè)備要求

對于豬精液冷凍效果較好的程序冷凍法要求儀器能控制液氮的噴出量，從而控制精子冷凍的降溫速率，但其價(jià)格昂貴，不能普及到豬場的實(shí)際應(yīng)用上。

3.2 操作要求嚴(yán)格

冷凍精液的質(zhì)量與其冷凍解凍的速率精密度成正比，尤其解凍的時(shí)間上要精確到秒，這對操作人員的操作水平要求極高，操作人員的技術(shù)水平與解凍后精子的質(zhì)量成正比。

3.3 影響因素復(fù)雜

精液質(zhì)量、稀釋液成分，冷凍方式，解凍溫度和時(shí)間及不同物種對冷凍精液的質(zhì)量影響顯著，目前還未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。王雪晗發(fā)現(xiàn)冷凍時(shí)液氮面熏蒸高度距離3 cm，熏蒸時(shí)間9 min，解凍時(shí)38 ℃水浴20 s，精子的質(zhì)量較好[15]。王捷發(fā)現(xiàn)冷凍精液稀釋液中添加2.0 μmol/L 番茄紅素、0.2 g/L 芝麻酚和0.04 g/L 黃芩素的對解凍后精子質(zhì)量效果較好，添加0.2g/L 芝麻酚和2.0 μmol/L 番茄紅素以及0.2 g/L 芝麻酚和2.5 μmol/L 番茄紅素能提高解凍后精子抗氧化能力[22]。凌培鳳發(fā)現(xiàn)同一冷凍液的豬冷凍精液的最佳解凍溫度為37 ℃ 30 s 和65 ℃ 5 s[42]。

4 小結(jié)

目前有關(guān)豬的精液冷凍保存技術(shù)的研究較多，較多的研究在于不同條件對精液冷凍保存影響結(jié)果，但關(guān)于影響的機(jī)制研究較少，對影響機(jī)制的研究有助于從根本上提高精液冷凍保存技術(shù)，為畜牧業(yè)優(yōu)良品種推廣及種質(zhì)資源保存做出貢獻(xiàn)。