鄧 樺，楊 鴻，蔣焱平，陳 剛，王少杰，周兆海，梁浩釗，盧玉葵

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231)

黏膜免疫系統(tǒng)是由呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道等黏膜相關(guān)淋巴組織共同構(gòu)成的相對(duì)獨(dú)立的免疫體系，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。腸黏膜免疫系統(tǒng)具有特殊結(jié)構(gòu)，直接參與和調(diào)控腸黏膜的免疫應(yīng)答，并可由此介導(dǎo)共同黏膜免疫調(diào)節(jié)和全身免疫反應(yīng)，具有重要的免疫功能[1-2]。中藥多糖可以明顯改善和增強(qiáng)腸黏膜免疫功能，保護(hù)和修復(fù)處于病變和應(yīng)激狀態(tài)的腸黏膜免疫屏障[3-4]。玉屏風(fēng)散由黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge)、白術(shù)(Atractylodesmacrocephala)和防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)組方而成，是提高機(jī)體免疫力的代表方劑。玉屏風(fēng)多糖(Yupingfeng poly-saccharides，YPF-P)為其有效部位群，是該方劑臨床藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。本項(xiàng)目組前期研究證實(shí)，玉屏風(fēng)多糖對(duì)特異性和非特異性免疫功能均有顯著的增強(qiáng)作用[5-6]，但迄今鮮見其對(duì)腸黏膜免疫系統(tǒng)調(diào)控作用的研究報(bào)道。

腸黏膜免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)部位為腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell，IEC)和腸黏膜下集合淋巴結(jié)(Peyre's Patch，PP結(jié))，PP結(jié)是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要部位，腸上皮細(xì)胞除具有吸收各種抗原的功能外，還具有攝取和釋放分泌型IgA(Secretory IgA，SIgA)、提呈抗原、分泌細(xì)胞因子等多種功能。腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞(intraepithelial lymphocytes，IELs)和黏膜固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria lymphocytes，LPLs)則是腸黏膜免疫的主要效應(yīng)部位[7]。

SIgA是腸黏膜免疫主要效應(yīng)因子，是黏膜免疫應(yīng)答的標(biāo)志指標(biāo)[8]。IL-2(interleukin-2，IL-2)是機(jī)體正常免疫功能的關(guān)鍵和免疫調(diào)節(jié)的中心，IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能。TGF-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)生IgA類型轉(zhuǎn)換，促進(jìn)SIgA的分泌，并可通過對(duì)IL-6基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生。升高IL-2等相關(guān)細(xì)胞因子可以保護(hù)腸黏膜免疫屏障，促進(jìn)受損腸黏膜免疫屏障的恢復(fù)[9]。

試驗(yàn)以黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)為對(duì)照藥物，以正常小鼠和免疫抑制小鼠為動(dòng)物模型，通過研究口服多糖對(duì)腸黏膜誘導(dǎo)部位的激活、效應(yīng)因子SIgA的分泌、腸黏膜效應(yīng)部位的反應(yīng)以及全身免疫應(yīng)答的聯(lián)系，探討玉屏風(fēng)多糖對(duì)小鼠腸黏膜免疫應(yīng)答和免疫損傷的調(diào)控效應(yīng)，為玉屏風(fēng)多糖的臨床應(yīng)用提供理論支撐與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 玉屏風(fēng)散配方依據(jù)《中國藥典》，黃芪、白術(shù)和防風(fēng)按照3∶1∶1質(zhì)量配方。以L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，水提醇沉法提取多糖，使用AB-8大孔樹脂純化精制，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空冷凍干燥，高效液相色譜法鑒定。所得玉屏風(fēng)多糖含量為90.75±2.3%，黃芪多糖的含量為90.68±5.1%。

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CY)，德國Baxter Oncology GmbH，批號(hào)5H072A；Mouse SIgA ELISA Kit(武漢華美公司，批號(hào) B10014455)；細(xì)胞因子試劑盒為ExCell Biology Inc.公司產(chǎn)品，Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit(批號(hào)21G037)，Mouse IL-2 ELISA Kit(批號(hào)21F287)，Mouse IL-6 ELISA Kit(批號(hào)21F361)。

1.2 動(dòng)物模型分組處理 150只SPF級(jí)NIH小鼠由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002。隨機(jī)分為5組，每組30只，雌雄各半?？瞻讓?duì)照組(blank control，BC組)：灌服生理鹽水；CY免疫抑制對(duì)照(negative control，NC組)：生理鹽水+CY；YPF-P治療組(YPF-P treatment，T組)：YPF-P+CY；YPF-P對(duì)照組(positive control，PC組)：僅給藥YPF-P；黃芪多糖對(duì)照組(APS control，AC)：僅給藥黃芪多糖。多糖劑量均為200 mg/Kg/d，每天禁水禁食4 h后灌胃給藥，連續(xù)7 d；CY劑量為80 mg/Kg，隔日腹腔注射。給藥劑量和時(shí)間參照課題組前期試驗(yàn)結(jié)果[5-6]。

1.3 IL-2、IL-6、TGF-β1和SIgA的檢測(cè) 小鼠摘眼球采血，分離血清，-20 ℃保存，用以檢測(cè)IL-2、IL-6、TGF-β1。取全段小腸，PBS沖洗，收集沖洗液，離心，取上清，-20 ℃保存，用以檢測(cè)SIgA。樣品均采用雙抗體夾心ELISA方法，按試劑盒說明書檢測(cè)。酶標(biāo)儀450 nm波長測(cè)定吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)濃度。

1.4 小腸及腸黏膜相關(guān)淋巴組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

分離十二指腸、空腸、回腸和PP結(jié)，取材，中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅(H.E)染色。采用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量各組十二指腸、空腸、回腸的小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與變化。每組各腸段選取6張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，于放大倍數(shù)100×，測(cè)量小腸絨毛長度和隱窩深度，計(jì)算腸絨毛長度與隱窩深度的比值(length villus / intestinal crypt，V/C)，于放大倍數(shù)400×，計(jì)數(shù)各段小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和黏膜固有層淋巴細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIgA的變化 由圖1可知，PC組和AC組SIgA含量增加最為明顯，顯著高于其他各組(P<0.01)；NC組SIgA含量為所有組別中最低，顯著低于BC組(P<0.05)；T組與NC組相比，SIgA含量顯著增高(P<0.05)，回復(fù)正常水平。

2.2 TGF-β1的變化 由圖1可知，與BC組相比，PC組增高最為顯著(P<0.01)，AC組也有明顯增高(P<0.05)，NC組顯著降低(P<0.05)；與NC組比較，T組顯著增高(P<0.05)，回復(fù)正常水平。

2.3 IL-6的變化 由圖2可知，與BC組相比，除NC組呈上升趨勢(shì)外，其余各組IL-6水平均明顯升高(P<0.01)。

2.4 IL-2的變化 見圖2。PC組增高最為顯著，其次為AC組，與BC組相比均為P<0.01，NC組和T組則顯著降低(P<0.05)；T組與NC組比較，雖略有上升但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5 小腸黏膜相關(guān)淋巴組織的變化 結(jié)果見表1、表2和圖3。玉屏風(fēng)多糖和黃芪多糖給藥后，PC組和AC組小鼠十二指腸、空腸和回腸腸壁增厚，腸絨毛長度、寬度和隱窩深度均顯著增加(P<0.05)；腸上皮細(xì)胞增生，杯狀細(xì)胞增多，中央乳糜管擴(kuò)張，內(nèi)有多量淋巴細(xì)胞；腸絨毛長度與隱窩深度的比值V/C升高(P<0.05或P<0.01)。隱窩內(nèi)潘氏細(xì)胞(Paneth cell)體積增大，嗜酸性顆粒增多。腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞IELs和黏膜固有層淋巴細(xì)胞LPLs數(shù)量明顯增多(P<0.05或P<0.01)。PP結(jié)顯著增生，體積增大，生發(fā)中心明顯。二者之間比較，玉屏風(fēng)多糖對(duì)小腸黏膜相關(guān)淋巴組織的影響較黃芪多糖更為顯著。

NC組免疫抑制小鼠腸壁變薄，PP結(jié)明顯萎縮變小。腸絨毛長度、寬度和隱窩深度下降，V/C下降(P<0.05或P<0.01)，IELs和LPLs數(shù)量顯著減少(P<0.01)。T組上述各項(xiàng)指標(biāo)均較NC組上升(P<0.05或P<0.01)。

同列數(shù)據(jù)右上標(biāo)小寫字母不同者表示P<0.05，大寫字母不同者表示P<0.01，下同Different lowercases in the same column indicated P<0.05; different cap-ital letters in the same column indicated P<0.01，the same as follows

組別十二指腸/μm空腸/μm回腸/μm絨毛長度隱窩深度V/C絨毛長度隱窩深度V/C絨毛長度隱窩深度V/CBC361.1±33.3Aa67.8±3.2a5.2±0.6a325.4±33.2ADa72.1±5.8a4.5±1.3a218.2±21.5Aa68.7±9.2a3.2±0.4AaNC210.6±20.5B45.5±6.8b4.6±0.5b196.2±26.8B40.7±3.4b4.9±0.6a170.1±16.2B41.2±6.8b4.1±0.2AbT321.1±25.4Ab58.1±5.2c5.5±0.3a289.4±16.3DCb48.9±6.1b5.8±1.2a192.8±19.1B45.3±7.1b4.2±0.3AbPC402.5±17.2C63.6±7.0ac6.5±0.8c415.4±17.2Ab62.7±3.8a6.7±0.4b347.5±21.2C60.8±7.8a5.8±0.5CaAC413.7±32.6C65.8±9.2ac6.6±1.4c395.3±20.2Ab70.1±5.2a5.9±1.1a323.7±20.5C72.4±9.5a4.7±0.6ACb

表2 小鼠小腸IELs和LPLs的變化(n=6)Tab 1 Changes of IELs and LPLs in mice

A. AC組回腸；B. PC組回腸；C. PC組隱窩；D. PC組中央乳糜管；NC組空腸；F. T組空腸；G. NC組PP結(jié)；H. T組PP結(jié)A. AC group ileum；B. PC group ileum；C. PC group crypt；D. PC group central lacteal；E. NC group jejunum；F. T group jejunum；G. NC group Peyre's Patch；H. T group Peyre's Patch圖3 小鼠小腸黏膜相關(guān)淋巴組織的形態(tài)學(xué)變化(H.E，標(biāo)尺100 μm)Fig 3 Histological changes of gut-associated lymphoid tissue in mice(H.E Staining, scale bar: 100 μm)

3 討論與結(jié)論

3.1 玉屏風(fēng)多糖可增強(qiáng)小鼠腸黏膜SIgA的分泌，緩解環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的SIgA含量下降 SIgA是腸黏膜免疫主要效應(yīng)因子，是腸黏膜免疫的重要免疫屏障，因此提高SIgA含量對(duì)于維持腸黏膜免疫功能具有重要意義[8-9]。試驗(yàn)結(jié)果表明，玉屏風(fēng)多糖和黃芪多糖均可通過提升SIgA含量來增強(qiáng)正常小鼠的腸黏膜免疫功能，具有明顯的免疫促進(jìn)作用。免疫抑制劑環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致小鼠腸SIgA含量顯著減少，降低腸黏膜免疫功能，玉屏風(fēng)多糖有效拮抗環(huán)磷酰胺的這一作用，恢復(fù)并提高小鼠腸SIgA含量。

3.2 玉屏風(fēng)多糖可影響細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡漂移 正常機(jī)體中輔助性T淋巴細(xì)胞亞群Th1/Th2 細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫功能異常時(shí)，Th1/Th2發(fā)生漂移，平衡失調(diào)。Th1/Th2 的變化影響細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡，與諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切[10]。

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于正常小鼠，玉屏風(fēng)多糖作用后，Th1細(xì)胞因子IL-2、TGF-β1和Th2細(xì)胞因子IL-6水平均顯著上升，Th1/Th2 上調(diào)，在高水平上達(dá)到新的平衡，提示玉屏風(fēng)多糖可明顯增強(qiáng)小鼠T、B淋巴細(xì)胞的活化增殖，促進(jìn)SIgA的分泌。在免疫抑制小鼠，IL-2和TGF-β1顯著降低，而IL-6雖未出現(xiàn)顯著性變化，但呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，Th1/Th2向Th2漂移，免疫應(yīng)答失調(diào)。結(jié)合文獻(xiàn)分析[11-12]，提示玉屏風(fēng)多糖可通過上調(diào)IL-2和TGF-β1水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2 漂移狀態(tài)，緩解環(huán)磷酰胺所致的免疫損傷。

3.3 玉屏風(fēng)多糖可保護(hù)腸黏膜免疫屏障的完整性，增強(qiáng)腸黏膜免疫功能 腸上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞(IELs)、黏膜固有層淋巴細(xì)胞(LPLs)、腸黏膜下集合淋巴結(jié)(PP結(jié))以及黏膜組織內(nèi)各種單核淋巴細(xì)胞共同構(gòu)成了完整的腸黏膜免疫屏障。腸上皮細(xì)胞參與SIgA的分泌，并有效轉(zhuǎn)運(yùn)SIgA從黏膜固有層進(jìn)入腸腔，還產(chǎn)生大量參與黏膜免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，腸上皮細(xì)胞與杯狀上皮細(xì)胞分泌的黏液組成機(jī)體與外界的第一道屏障。PP結(jié)是腸黏膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和活化部位；IELs被激活后可釋放IL-2和干擾素-ɑ、γ等多種細(xì)胞因子，參與機(jī)體免疫監(jiān)控和免疫防御；LPLs包括B、T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，可分泌IgA和IgM[1,13]。

試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，玉屏風(fēng)多糖和黃芪多糖對(duì)腸黏膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位作用明顯，小鼠腸上皮細(xì)胞增生，杯狀細(xì)胞增多，腸絨毛長度、寬度和隱窩深度均顯著增加，腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞和黏膜固有層淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，PP結(jié)體積增大，淋巴細(xì)胞增生。與黃芪多糖比較，玉屏風(fēng)多糖對(duì)腸黏膜免疫屏障各項(xiàng)指標(biāo)的影響更為明顯。而免疫抑制小鼠腸黏膜免疫屏障的損傷，可被玉屏風(fēng)多糖有效緩解和改善。

綜上所述，玉屏風(fēng)多糖對(duì)腸黏膜誘導(dǎo)部位(IEC和PP結(jié))的激活、效應(yīng)因子SIgA的分泌、腸黏膜效應(yīng)部位(IELs和LPLs)的反應(yīng)以及全身免疫應(yīng)答(血清IL-2、IL-6和TGF-β1)影響明顯，可從多方面調(diào)控小鼠腸黏膜的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)腸黏膜免疫功能，并可有效緩解和改善免疫抑制小鼠腸黏膜免疫屏障的損傷。