徐天依 寧保安 劉穎

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究所環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所)

目前，大部分臨床檢驗都需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的工作人員使用專業(yè)儀器進行樣品采集，測試和分析。配備這些專業(yè)人員費用較高，并且檢測結(jié)果會受到由操作者錯誤造成系統(tǒng)誤差的影響。這些臨床實驗室檢測手段耗時，操作復(fù)雜，而且造價昂貴。因此，急需開發(fā)造價低廉，反應(yīng)靈敏，快速，便攜式，無需標(biāo)記和易于操作的醫(yī)療檢測工具。光子晶體(PC)是具有不同介電常數(shù)的周期性排列的材料，特殊的周期性的結(jié)構(gòu)使它們具有很多獨特的光學(xué)性質(zhì)。當(dāng)PC結(jié)構(gòu)受到外界的刺激而變化時，其產(chǎn)生的光學(xué)現(xiàn)象也會隨之改變?；谶@一原理開發(fā)的PC傳感器具有許多超越現(xiàn)有的其他競爭型生物傳感技術(shù)的優(yōu)點，比如制造方法簡單，成本經(jīng)濟實惠和測定時間短。PC結(jié)構(gòu)現(xiàn)已被用于檢測多種生物樣品中的生物標(biāo)志物，如血液、尿液、汗液和眼淚等，其應(yīng)用前景不可估量。

1 PC傳感技術(shù)簡介

PC結(jié)構(gòu)是由介電材料在空間中周期性排列形成，這種特殊的結(jié)構(gòu)會使電磁波受到入射光在介電邊界處反射的影響而不能傳播，即產(chǎn)生光子帶隙(PBG)，這也是PC材料最主要的光學(xué)特征〔1〕。在應(yīng)用中，PC結(jié)構(gòu)可以在一維(1-D)，二維(2-D)或三維(3-D)方向上制造，包括微腔，波導(dǎo)，平板，多層薄膜及多孔規(guī)則幾何形狀〔2～6〕。一維PC(1D-PC)結(jié)構(gòu)最為簡單，其周期性僅存在于一個維度中，也被稱為布拉格反射器或布拉格反射堆，它們只能特定地反射一種波長，通常通過逐層沉積，多次旋涂或光刻等技術(shù)來制備〔7〕。二維PC(2D-PC)結(jié)構(gòu)的特征為其在兩個空間方向上的周期性，主要通過復(fù)雜的自上而下方法制造，例如納米壓印光刻和電化學(xué)蝕刻技術(shù)等〔8〕。盡管2D-PC的溝槽和多孔結(jié)構(gòu)為生物化學(xué)相互作用提供了更高的表面積，但當(dāng)應(yīng)用于臨床樣品時較大的生物分子(例如細胞)可能會在通道內(nèi)聚集，甚至導(dǎo)致阻塞。三維PC(3D-PC)結(jié)構(gòu)在立體三維中具有周期性。常見的3D-PC結(jié)構(gòu)例如蛋白石PC和反蛋白石PC，這種稱謂源于自然界中一類存在三維周期性結(jié)構(gòu)的礦石，其表面十分光滑且具有炫目的虹彩色。制備3D-PC的方法有很多，其中化學(xué)自下而上的方法相對而言更經(jīng)濟簡便，主要是通過納米級的單分散微球進行自組裝來構(gòu)成PC主體，自組裝法是利用了顆粒間相互作用的特性，例如靜電斥力、磁力、慣性力和毛細現(xiàn)象等〔9〕。微球取材廣泛，可以選擇二氧化硅、氧化鋅、二氧化鈦或有機聚合物如聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯等〔10〕。3D-PC陣列是由存在于空氣或溶劑等電介質(zhì)中的電介質(zhì)微球構(gòu)成。將布拉格定律與Snell折射定律相結(jié)合可以發(fā)現(xiàn)，如果反射波長受化學(xué)或生物相互作用的刺激而改變，會使PC結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列光學(xué)現(xiàn)象變化，可以應(yīng)用于傳感檢測〔11〕。微球中心距離和介質(zhì)折射率是兩個可導(dǎo)致反射波長變化的變量。兩者經(jīng)常同時變化，其中改變晶格間距通常更為容易，但利用折射率變化或單個光子晶體改變的傳感器則具有更高的靈敏度和更快的響應(yīng)時間，例如在PC中引入水凝膠制作反蛋白石PC〔12〕。PC表面受外部刺激引起有效折射率的變化，從而使共振波長峰值發(fā)生偏移，其偏移量可用于評價生物化學(xué)作用的情況。 目前PC結(jié)構(gòu)在開發(fā)生物化學(xué)傳感器領(lǐng)域已經(jīng)獲得了極大的關(guān)注，已被廣泛應(yīng)用于捕獲，檢測和量化各種生物分子，如病原體、核酸、蛋白質(zhì)、酶、葡萄糖、細胞和癌癥生物標(biāo)志物等〔13～19〕。

2 PC傳感技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用進展

2.11D-PC 1D-PC主要由材質(zhì)不同的兩種薄膜交替排列而成，由于其與光發(fā)生鏡面反射，因此制作中不宜選用對光吸收較強和散射作用較大的材料。Bouzidi等〔20〕提出了一種基于1D-PC結(jié)構(gòu)的生物傳感器，用于監(jiān)測血糖。該研究將1D-PC中兩種材料的交替層中間的空層注滿血液，血液層導(dǎo)致透射光PBG內(nèi)出現(xiàn)電磁模式，其頻率取決于血液中葡萄糖的濃度，進而達到了檢測的目的。Sinibaldi等〔21〕報道了使用一種利用1D-PC與外部均勻介質(zhì)之間的布洛赫表面波，結(jié)合熒光檢測的光學(xué)平臺，可對細胞裂解液中乳腺癌生物標(biāo)志物ERBB2臨床相關(guān)濃度進行檢測，檢測限為0.3 ng/ml(1.5 pmol/L)。另外Rizzo等〔22〕利用Bloch表面波特性設(shè)計了一種新型集成生物傳感平臺。作者將1D-PC直接沉積在低成本的一次性塑料生物芯片上，使用夾心免疫測定法檢測緩沖液、細胞上清液和人血漿中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，該平臺在人血漿樣品中檢測到低至3.5 ng/ml的VEGF，且分辨率高，檢測速度快(30 min)，并且與酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果非常一致。但1D-PC的結(jié)構(gòu)相對簡單，大部分情況下只作為傳感元件，具體檢測還需要依賴一些外部設(shè)備，如熒光檢測等，這也限制了它在臨床檢測中的應(yīng)用。

2.22D-PC材料 2D-PC的制造方式有很多，其中納米壓印光刻(NIL)是一種快速，簡單且可擴展的圖案轉(zhuǎn)移技術(shù)，可替代需要昂貴設(shè)備和復(fù)雜操作的電子束光刻。在NIL方法中，首先在母模上使用深紫外或電子束光刻生成圖案，然后可以輕松地將其轉(zhuǎn)移到復(fù)制品上。Endo等〔23〕成功通過NIL技術(shù)制造了2D-PC聚合物，并將慢性阻塞性肺病(COPD)的生物標(biāo)志物纖維蛋白原的抗原修飾在其表面，利用抗原-抗體的高靈敏度反應(yīng)，使PC的衍射峰發(fā)生紅移，即可在1 h內(nèi)有效地?zé)o標(biāo)記檢測纖維蛋白原，檢測限為100 pg/ml。另有Su等〔24〕根據(jù)涂覆金的2D-PC上局域表面等離子體共振(LSPR)的變化實現(xiàn)對載脂蛋白E4基因序列相關(guān)DNA的檢測。這項研究中，作者使用了NIL方法在柔性共聚物膜上制造2D-PC結(jié)構(gòu)，證明其具有制作應(yīng)用于診斷方面的小型化和可穿戴式生物傳感器的前景。目前NIL方法已被用于快速可靠地批量生產(chǎn)PC結(jié)構(gòu)，然而由于磨損，單個模具可制備的復(fù)制品數(shù)量有限，模具的使用壽命也較短〔8〕。2D-PC結(jié)構(gòu)也可以與水凝膠結(jié)合制作傳感器，其優(yōu)勢在于①2D陣列和水凝膠可獨立制造，2D陣列可以在聚合過程中附著在水凝膠表面上或嵌入水凝膠中;②傳感器的響應(yīng)可以通過測量德拜環(huán)而不是使用光譜儀來確定;③2D-PC傳感器的讀數(shù)是可靠的，因為來自2D材料的衍射光與折射率無關(guān)。高敏君等〔25〕將分子印跡技術(shù)與2D-PC水凝膠結(jié)合起來，制備了一種特異性檢測紅霉素的PC傳感器，通過測量由于單色光垂直射入2D-PC結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的德拜環(huán)的變化，來反映紅霉素的濃度。另有一項研究，Chen等〔26〕提出了一種新型的凝膠化單層膠體晶體PC材料，用于監(jiān)測淚液中的葡萄糖。研究者將二維組裝的微球膠體包埋在4-硼苯甲醛修飾的聚乙烯醇(PVA)水凝膠中。當(dāng)葡萄糖分子與硼酸鹽結(jié)合時，PVA和硼酸根離子的比例發(fā)生變化，導(dǎo)致水凝膠體積改變，伴隨著結(jié)構(gòu)色明顯轉(zhuǎn)變。在180 s內(nèi)，葡萄糖濃度從0變化到20 mmol/L，其結(jié)構(gòu)顏色可以從紅色變?yōu)辄S色再變?yōu)榫G色。作者進一步檢測了眼淚中葡萄糖濃度，證明該傳感器具有高精度和高靈敏度特征，這種智能傳感材為進一步開發(fā)例如用于葡萄糖點監(jiān)測的隱形眼鏡等可穿戴醫(yī)療器材提供了一定的可能性。

2.33D-PC 3D-PC可分為孔洞型和非孔洞型材料，孔洞型材料主要指3D有序的多空穴材料，是指向堆壘好的膠體PC中灌入交聯(lián)劑，通過紫外光照射等手段使交聯(lián)劑發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，再通過腐蝕或煅燒手段將膠體顆粒除去，形成具有有序結(jié)構(gòu)的大孔材料。非孔洞型材料是指單分散的膠體顆粒在介質(zhì)中周期性排列形成的PC結(jié)構(gòu)。介質(zhì)為空氣時形成的結(jié)構(gòu)稱為膠體晶體，介質(zhì)為單體水凝膠交聯(lián)聚合時形成的結(jié)構(gòu)稱為膠體晶體有序陣列(PCCA)。Wu等〔27〕提出了一種蛋白石PC傳感材料，可以無標(biāo)記檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)。由甲基丙烯酸甲酯和3-丙烯酰胺基苯基硼酸聚合而成的單分散微球，通過垂直沉降自組裝，堆壘成PC，利用TRF與微球上硼酸基團的反應(yīng)，制備成對TRF特異性響應(yīng)的PC傳感器，隨著TRF濃度增加，衍射峰強度降低。TRF的檢測限為2×10-3～200 ng/ml，并進行了模擬尿樣中TRF濃度的測量，為臨床診斷中的TRF測定提供了廉價且易于使用的替代方案。Elsherif等〔28〕將微工程光學(xué)漫射器結(jié)構(gòu)壓印在苯基硼酸官能化水凝膠薄膜中，漫射器使入射光聚焦在不同焦距和方向上，從而在透射和反射模式中讀出漫射的光分布。由于苯硼酸可以可逆地與葡萄糖分子的順式二醇結(jié)合，使水凝膠體積膨脹，改變其陣列原有秩序，進而改變水凝膠薄膜的焦距，因此可以測量通過傳感器的透射光學(xué)光傳播和強度，以確定生理條件下葡萄糖濃度的變化。作者將這種傳感器集成在隱形眼鏡中并放置在人造眼睛上。人工刺激葡萄糖濃度的變化可以使用智能手機的光電二極管進行定量測量。利用智能手機app將接收光強度轉(zhuǎn)換為定量葡萄糖濃度值。這種檢測方案可以設(shè)置在可穿戴實時生物標(biāo)志物監(jiān)測設(shè)備中以供護理點使用。Lee等〔29〕制備了基于SiO2的反蛋白石PC結(jié)構(gòu)作為生物傳感器。作者使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，琥珀酰亞胺基-N-馬來酰亞胺基丙酰胺基-四乙二醇酯作為交聯(lián)劑制備了反蛋白石PC結(jié)構(gòu)，然后利用蛋白G將抗體固定在其表面來捕獲流感病毒。由于抗體抗原特異性結(jié)合造成有序大孔材料結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致衍射峰的紅移，可以通過監(jiān)測反射光譜來無標(biāo)記檢測流感病毒。該材料在噬斑103～105單位(PFU)范圍內(nèi)顯示出高靈敏度，并且對甲型H1N1流感病毒具有高度特異性。另外3D有序孔洞型材料還可以與記憶材料結(jié)合，通過多空穴的塌陷和復(fù)位來可逆的檢測氣體中的丙酮〔30〕，由于糖尿病患者呼吸中含有丙酮，該技術(shù)有望應(yīng)用于糖尿病酮癥酸中毒的監(jiān)測。

3 結(jié) 語

臨床上對生物分子的檢測面臨多重挑戰(zhàn)，包括缺乏集中化實驗室，技術(shù)能力有限，缺乏熟練員工及醫(yī)療保健管理系統(tǒng)較差(特別是在資源有限的環(huán)境中)等問題?；赑C的生物傳感器代表了一類先進的新型光學(xué)生化傳感器，可以一定程度上解決這些難題。PC材料可以通過簡單的手段，使用便宜的原料如金屬、氧化物、塑料、聚合物和玻璃等來大量生產(chǎn)。最近，PC結(jié)構(gòu)已經(jīng)與智能手機，柔性材料和可穿戴傳感器等新興技術(shù)相結(jié)合，這更提高了它作為診斷工具的利用率。但臨床樣品中通常包含細胞和組織等復(fù)雜的生物流體，這些可能干擾PC傳感器的換能過程，并且一些PC結(jié)構(gòu)目前只做到了定性檢測，還需研發(fā)更精確的讀出系統(tǒng)。雖然仍有很多難關(guān)尚未攻克，但PC材料應(yīng)用于臨床檢測的前景不容小覷，這需要我們繼續(xù)努力，開發(fā)出更加方便快捷，經(jīng)濟實用的臨床醫(yī)療檢測設(shè)備。