神經(jīng)干細(xì)胞移植治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展

朱清 陳艷 胡楠 高漢雄 姜榮榮

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 511436)

阿爾茨海默病(AD)是一個(gè)多病因的神經(jīng)退行性疾病，炎癥與氧化應(yīng)激，代謝障礙，鈣離子通道受損，線粒體障礙，神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)缺乏等都與AD的發(fā)生密切相關(guān)〔1，2〕，這些病因?qū)е铝薃D的治療缺乏特異性。神經(jīng)元的損傷和丟失是大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的共同的最后通路，AD復(fù)雜的病理改變，最終導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元損傷和丟失，引起學(xué)習(xí)記憶障礙。目前臨床上AD的治療如藥物治療、基因治療、康復(fù)訓(xùn)練等〔3〕只能改善癥狀，并不能阻止疾病的進(jìn)展。近年來，神經(jīng)再生理論的發(fā)展和干細(xì)胞體外分離及培養(yǎng)的成功，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了一個(gè)嶄新的視野，尤其是神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在AD的治療上發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。細(xì)胞移植治療可以從根本上解決AD神經(jīng)細(xì)胞丟失的問題。本文從治療AD的干細(xì)胞種類、NSCs移植治療AD、NSCs聯(lián)合神經(jīng)生長因子(NGF)移植治療AD三個(gè)方面展開綜述。

1 干細(xì)胞治療AD的基礎(chǔ)

1.1胚胎干細(xì)胞(ESCs) ESCs來自囊胚期(胚胎5～6 d)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，能夠向內(nèi)、中、外三胚層細(xì)胞分化，理論上，ESCs可以誘導(dǎo)分化為機(jī)體內(nèi)所有類型的細(xì)胞〔4〕。ESCs分化與微環(huán)境密切相關(guān)，研究提示，ESCs作為一種更“原始”的全能干細(xì)胞，具有分化多樣性的同時(shí)也存在分化難調(diào)控性，其在體內(nèi)難以定向分化為功能性神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞增殖失控和腫瘤形成限制了ESCs在體應(yīng)用〔5〕。研究者們致力于研究一種簡單卻行之有效的方法，即將ESCs體外預(yù)先分化為神經(jīng)前體細(xì)胞/神經(jīng)元，再進(jìn)行在體移植，結(jié)果顯示，各種AD動(dòng)物模型的認(rèn)知功能均有一定程度的恢復(fù)，未見腫瘤形成〔6～8〕。盡管ESCs的前臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開展，但是，ESCs潛在的免疫排斥反應(yīng)及來源限制仍然是阻礙ESCs應(yīng)用的關(guān)鍵。

1.2間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) MSCs包括骨髓、脂肪組織、滑膜、臍帶、胎血、肺、肝臟等〔9〕。MSCs因無倫理限制和免疫排斥反應(yīng)，比ESCs略占優(yōu)勢。在目前的研究中，MSCs中又以骨髓MSCs(BMSCs)和從人胎盤及其附屬物中分離得到的包括羊膜MSCs(AM-MSCs)、臍帶MSCs(UC-MSCs)等研究的最為深入。在特定條件下，MSCs可以分化為不同組織類型的細(xì)胞，例如骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。Lee等〔10〕將骨髓來源的MSCs 移植入淀粉樣前體蛋白/早老素(APP/PS)1小鼠海馬中，結(jié)果顯示BMSCs移植能夠明顯激活小膠質(zhì)細(xì)胞，緩解Aβ負(fù)荷，與此同時(shí)降低Tau蛋白過度磷酸化，移植之后小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。Zheng等〔11〕做了類似研究，將人AM-MSCs海馬移植轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果顯示AM-MSCs 移植使神經(jīng)發(fā)生增強(qiáng)，突觸密度增加；與此同時(shí)，AM-MSCs 移植調(diào)節(jié)腦內(nèi)炎癥環(huán)境，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能，減少Aβ水平，最終學(xué)習(xí)記憶功能顯著改善。不同來源的MSCs在治療神經(jīng)退行性疾病方面具有廣闊的前景，雖然MSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的機(jī)制尚不完全清楚，已經(jīng)證實(shí)MSCs可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，刺激血管生成，抗凋亡及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等〔12〕。國外學(xué)者開展了臨床Ⅰ期的實(shí)驗(yàn)，將人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)移植到AD患者雙側(cè)海馬和一側(cè)楔前葉(低劑量3.0×106個(gè)細(xì)胞和高劑量6.0×106個(gè)細(xì)胞)，事實(shí)證明，干細(xì)胞移植是安全可行的方法，9名受試者未發(fā)生干細(xì)胞相關(guān)的不良反應(yīng)，在后期兩年隨訪實(shí)驗(yàn)中，未見腦出血、腫瘤形成及其他生理生化指標(biāo)異常。但是，hUCB-MSCs移植并沒有改善β淀粉樣蛋白(Aβ)負(fù)荷，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖。研究者認(rèn)為，出現(xiàn)這一現(xiàn)象與檢查指標(biāo)的方式、腦內(nèi)微環(huán)境、移植物的來源甚至與物種發(fā)展有關(guān)，即低級(jí)物種接受高級(jí)物種干細(xì)胞移植將會(huì)受益更多〔13〕。目前，MSCs在腦脊髓損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、帕金森病(PD)的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)陸續(xù)開展。

1.3誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs) iPSCs最初由國外兩學(xué)者Takahashi和Yamanaka提出并命名，其原理是將已分化的體細(xì)胞經(jīng)過特殊基因重編程恢復(fù)到未分化原始水平，使其具有干細(xì)胞的基本特性〔14〕。iPSCs具有自我更新和多向分化的潛能，可從患者自身取材，不存在免疫排斥、倫理等問題，為干細(xì)胞治療帶來了新的希望。近十年來，iPSCs在各領(lǐng)域研究頗多，由iPSCs來源的細(xì)胞在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域如AD,PD及ALS等疾病的治療方面取得了較滿意的成績。Fujiwara等〔15〕將人iPSCs體外誘導(dǎo)分化為膽堿能表型的神經(jīng)元細(xì)胞，將此種細(xì)胞移植PD APP小鼠(一種年齡依賴性Aβ沉積和漸進(jìn)性認(rèn)知障礙的轉(zhuǎn)基因鼠)雙側(cè)海馬，結(jié)果顯示移植的細(xì)胞存活，并能分化為膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽性神經(jīng)元及γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元，細(xì)胞移植組小鼠的空間記憶能力明顯提高。除了細(xì)胞移植外，iPSCs在人類疾病模型和藥物監(jiān)測方面也具有極大的發(fā)揮空間〔16〕。但是iPSCs用于臨床仍然存在一些亟待解決的問題，比如iPSCs誘導(dǎo)率比較低下及潛在的腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。雖然iPSCs是從患者自身體細(xì)胞重編程而來，但仍有報(bào)道稱iPSCs來源的細(xì)胞存在免疫原性，這可能與iPSCs來源的某些終末分化的細(xì)胞類型有關(guān)〔5〕。

1.4NSCs NSCs主要來自胚胎或胎兒神經(jīng)組織，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)成年哺乳動(dòng)物大腦中也存在大量NSCs。NSCs具有很強(qiáng)的自我更新及多向分化潛能，能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。近二十年來，NSCs成功的體外培養(yǎng)為神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞治療帶來了希望，相對于ESCs、iPSCs、MSCs來說，NSCs作為神經(jīng)祖細(xì)胞，具有更小的導(dǎo)致腫瘤的可能性及免疫原性?；浊澳X膽堿能功能障礙，導(dǎo)致投射入海馬和皮層的膽堿能神經(jīng)元減少，而這些區(qū)域神經(jīng)元損傷或丟失是引起AD認(rèn)知功能障礙的根本原因。在這種情況下，外源性NSCs的輸入顯得尤為重要，可以直接替代腦內(nèi)丟失或損傷的神經(jīng)元，此外還可以分泌NT，抗炎癥反應(yīng)和減輕Aβ負(fù)荷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善認(rèn)知功能。目前，NSCs在ALS、腦卒中、癲癇的試驗(yàn)性治療已經(jīng)開展，并且植入物未引起中樞體液免疫反應(yīng)。盡管NSCs治療AD在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有較多的成功案例，但臨床應(yīng)用目前依然處于探索階段。

2 NSCs移植治療AD

2.1AD與NSCs發(fā)生 側(cè)腦室室管膜下層(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)存在神經(jīng)發(fā)生，在神經(jīng)發(fā)生損傷時(shí)，此處的NSCs可以增殖并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，遷移至大腦適當(dāng)?shù)膮^(qū)域并整合入宿主神經(jīng)系統(tǒng)，修復(fù)神經(jīng)回路。神經(jīng)發(fā)生受內(nèi)外在因素的調(diào)控，在適應(yīng)性反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶過程、腦損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用〔17〕。研究表明，神經(jīng)發(fā)生的損害能夠引起嚙齒動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能障礙。但是在AD腦內(nèi)，神經(jīng)發(fā)生是增加還是減少仍飽受爭議。一些研究證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因AD模型鼠中，神經(jīng)干/前體細(xì)胞(NS/PCs)的增殖和存活明顯減弱，分化能力降低，可補(bǔ)充的神經(jīng)元大量減少及凋亡增加，這種現(xiàn)象與Aβ有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，AD腦組織中Aβ沉積可中斷神經(jīng)發(fā)生，并對外源性NSCs的存活、增殖有明顯抑制作用，Aβ對NSCs的抑制可能與鈣超載及激活胱門蛋白酶(caspases)有關(guān)〔18,19〕。體外研究得到了同樣的結(jié)果，Aβ42通過激活caspase信號(hào)通路促進(jìn)人NPCs凋亡。有趣的是，有研究者對AD動(dòng)物模型和AD患者尸檢發(fā)現(xiàn)，海馬DG和CA1區(qū)神經(jīng)發(fā)生增加〔20〕，這與Jin等〔21〕研究結(jié)果類似，即AD患者海馬區(qū)NSCs的數(shù)量和未成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白的表達(dá)增加，但成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白沒有增加。Li等〔22〕同樣發(fā)現(xiàn)AD患者DG區(qū)未成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白輕微減少，成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白明顯減少。這些結(jié)果表明，AD中神經(jīng)發(fā)生是增加還是減少，目前出現(xiàn)兩種不同的結(jié)論，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與選擇神經(jīng)元的標(biāo)志物、檢測的手段、AD動(dòng)物模型及疾病所處不同年齡階段均有關(guān)系。但是，AD中內(nèi)源性神經(jīng)再生增加有可能僅僅是大量神經(jīng)元破壞情況下的一種代償反應(yīng)，而損害的神經(jīng)元刺激的神經(jīng)再生往往不能達(dá)到滿意的修復(fù)效果。最終趨于一致的結(jié)論是：AD中成熟的神經(jīng)元減少，不能完成相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶障礙。

2.2外源性NSCs與AD 內(nèi)源性神經(jīng)再生損害或神經(jīng)再生不足導(dǎo)致功能性神經(jīng)元減少，最終引起AD認(rèn)知功能受損。NSCs移植緩解AD模型鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，一方面移植的NSCs存活、遷移、并分化為神經(jīng)元，補(bǔ)充丟失的神經(jīng)細(xì)胞；另一方面移植的NSCs分泌NT，保護(hù)移植細(xì)胞的存活，并部分改善AD腦內(nèi)的病理微環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)源性NSCs激活〔23,24〕。盡管干細(xì)胞治療在哺乳動(dòng)物中有較多的證據(jù)，但是干細(xì)胞治療AD的臨床試驗(yàn)寥寥可數(shù)。

細(xì)胞移植治療可以從根本上解決AD中神經(jīng)細(xì)胞丟失的問題，其可能的機(jī)制為:①替換損傷和丟失的神經(jīng)細(xì)胞，干細(xì)胞可分化為膽堿能神經(jīng)元，與宿主整合，修復(fù)神經(jīng)通路，直接替代丟失的神經(jīng)元，是能夠治愈神經(jīng)退行性疾病的根本原因；②分泌營養(yǎng)因子，干細(xì)胞可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子如NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、NT-3等促進(jìn)細(xì)胞存活，增加突觸連接，改善認(rèn)知功能；③抗淀粉樣蛋白生成，干細(xì)胞移植減少Aβ水平，減輕Aβ毒性反應(yīng)，有利于移植細(xì)胞存活及認(rèn)知恢復(fù)；④抗炎癥反應(yīng)，干細(xì)胞移植減少促炎因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；⑤促進(jìn)內(nèi)源性NSCs激活，外源性NSCs移植改善腦內(nèi)微環(huán)境，有利于內(nèi)源性NSCs存活并刺激其激活；⑥提高腦內(nèi)神經(jīng)元代謝活動(dòng)，干細(xì)胞移植增加神經(jīng)元之間連接及代謝，改善認(rèn)知功能〔25,26〕。

大量研究表明，將NSCs移植到腦內(nèi)，移植的NSCs可在體內(nèi)存活、遷移并分化為功能性神經(jīng)元，整合入宿主神經(jīng)回路，修復(fù)神經(jīng)功能。Ager等〔27〕將人NSCs移植到3xTg-AD模型鼠海馬中發(fā)現(xiàn)，移植的NSCs存活、集中在海馬CA1區(qū)周圍，并廣泛遷移至胼胝體，移植6 w后仍然有將近40%細(xì)胞存活。移植的NSCs能夠分化神經(jīng)元，但分化緩慢，2 w后仍有大量干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)；AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能改善可能與神經(jīng)連接增強(qiáng)和神經(jīng)元代謝活動(dòng)提高有關(guān)〔25〕。NSCs的分化與腦內(nèi)微環(huán)境有關(guān)，而且，單純NSCs移植入腦內(nèi)，此分化條件無法掌控，對膽堿能神經(jīng)元的補(bǔ)充有限。據(jù)此，一些學(xué)者在體外將NSCs分化為膽堿能樣神經(jīng)元，再進(jìn)行腦內(nèi)移植。結(jié)果表明，3個(gè)月后移植的膽堿能樣神經(jīng)元在體內(nèi)近82%分化為膽堿能神經(jīng)元，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組能夠明顯改善學(xué)習(xí)記憶能力及突觸功能。移植前誘導(dǎo)分化為膽堿能樣神經(jīng)元能夠更好地解決AD中膽堿能功能的退化〔28〕，但是，神經(jīng)干細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)的“祖”細(xì)胞，屬于未分化的原始細(xì)胞，移植后不容易發(fā)生異體排斥反應(yīng)，若在體外分化為神經(jīng)元再進(jìn)行移植，可能會(huì)增加免疫源性，不利于其存活；其次，已分化的細(xì)胞遷移性差，使治療相對局限，不利于廣泛性腦內(nèi)病變的治療。

3 神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)因子移植

誘導(dǎo)移植的NSCs分化為膽堿能神經(jīng)元以補(bǔ)充丟失和損傷神經(jīng)元是目前AD治療研究的熱點(diǎn)。大量研究表明，NT可影響正常神經(jīng)干細(xì)胞甚至AD中異常神經(jīng)干細(xì)胞的存活、增殖和分化〔29〕。例如，NGF、BDNF、NT-3均可促進(jìn)外源性NSC存活、增殖和分化。改變NSCs的因子微環(huán)境對NSC的激活發(fā)揮治療作用極其重要。

3.1NGF NGF在1950年初次發(fā)現(xiàn)，之后，研究者們對NGF誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元及NGF的神經(jīng)保護(hù)作用做了大量的體外及在體實(shí)驗(yàn)研究。體外研究表明，NGF可促進(jìn)NSCs分化為膽堿能神經(jīng)元，且不分種屬來源，并且ChAT的活性及水平呈現(xiàn)劑量依賴式提高〔30，31〕。NGF除了誘導(dǎo)干細(xì)胞分化外，還可以與其功能性受體TrKA和P75結(jié)合，防止細(xì)胞核和線粒體程序性死亡起到神經(jīng)保護(hù)作用〔32〕。有趣的是，在AD動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)了成熟NGF減少，一些研究表示，NGF的慢性消耗促進(jìn)了AD樣神經(jīng)退行性疾病發(fā)生，包括神經(jīng)元丟失、膽堿能損害、tau蛋白磷酸化、Aβ斑塊聚集等，而這些病理反應(yīng)又導(dǎo)致了NGF水平下調(diào)〔33〕，NGF水平下降成為了這一惡性循環(huán)的重要中間環(huán)節(jié)。NGF因其誘導(dǎo)NSCs分化、保護(hù)膽堿能神經(jīng)元、增加突觸功能、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外Aβ的沉積及改善認(rèn)知的作用〔34〕，在治療神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域的優(yōu)越性日漸凸顯。一項(xiàng)為期10年臨床治療從2001年3月到2011年10月，10個(gè)早期AD患者接受了NGF基因治療，研究顯示，退化的神經(jīng)元可對NGF做出反應(yīng)，具體表現(xiàn)為軸突出芽和細(xì)胞肥大；并且相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)被激活〔35〕。不管是體外還是在體實(shí)驗(yàn)中，NGF都顯示了舉足輕重的治療作用。

3.2NGF聯(lián)合NSCs治療AD 單純NSCs移植存在移植細(xì)胞存活率低、分化為神經(jīng)元數(shù)量少等問題。NGF具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)膽堿能分化的作用，NGF與NSC聯(lián)合移植治療AD可促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化，同時(shí)還可促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的激活。但是，NGF應(yīng)用也有相應(yīng)的局限性，一方面，NGF作為一種大分子蛋白質(zhì)，難以透過血腦屏障(BBB)，不利于腦靶向給藥；其次，NGF半衰期短，腦內(nèi)注射很快被稀釋和代謝，若反復(fù)注射會(huì)增加顱內(nèi)感染的概率并誘發(fā)疼痛，這些都限制了NGF的應(yīng)用。為了提高NGF的生物利用度，研究者們致力于研究一種緩釋的、可控的安全有效的NGF藥物遞送系統(tǒng)(DDS)-NGF納米遞釋系統(tǒng)。

NGF納米遞釋系統(tǒng)能以一種安全有效的方式在腦內(nèi)達(dá)到緩釋效果，比鼻內(nèi)注射或側(cè)腦室注射更能充分利用NGF，并能減少相應(yīng)的副作用。脂質(zhì)體、聚合物膠束、納米粒是目前最常用納米遞釋系統(tǒng)。

研究發(fā)現(xiàn)腦靶向分子乳鐵蛋白修飾的NGF脂質(zhì)體能夠透過人腦微血管內(nèi)皮，并且能保護(hù)Aβ42誘導(dǎo)的SK-N-MC細(xì)胞損傷；但是體外釋放的研究發(fā)現(xiàn)在最初的48 h內(nèi)，釋放總量可達(dá)到72%～90%〔36〕。轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的脂質(zhì)體可以提高齲齒動(dòng)物腦內(nèi)NGF基因表達(dá)，促進(jìn)腦損傷的修復(fù)〔37〕。修飾的脂質(zhì)體除了用于治療外，還可以用于疾病的診斷，例如有研究者將PEG修飾的脂質(zhì)體形成的隱形脂質(zhì)體能夠識(shí)別AD中淀粉樣蛋白靶向分子，靜脈注射APP/PS1小鼠后，脂質(zhì)體透過BBB，并結(jié)合淀粉樣斑塊，實(shí)現(xiàn)對AD的診斷〔38〕。脂質(zhì)體作為遞釋載體的給藥系統(tǒng)需要解決其載藥量的問題；另外，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性及長循環(huán)的特性也是影響遞送效率的關(guān)鍵。聚合物膠束是由PEG提供親水的外殼，聚合物PLA、PLGA、PPO或者PCL組成疏水的內(nèi)核〔34〕。膠束的親水性外殼可逃避免疫系統(tǒng)的清除，疏水性內(nèi)核可以包載疏水性或難溶性藥物,提高藥物的穩(wěn)定性。但包載NGF膠束的研究少有報(bào)道。

聚合物納米粒是將藥物包載于以高分子聚合物為載體材料的骨架中或吸附在其表面而形成，因其控釋和緩釋的作用，是目前研究最多的藥物遞釋系統(tǒng)。包載藥物的聚合物載體材料包括殼聚糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)、聚己丙酯(PCL)、α-聚氰基丙烯正丁酯(PBCA)等，其中PLGA已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA) 批準(zhǔn)用于組織工程和藥物載體的應(yīng)用。體外研究表明，神經(jīng)生長因子納米粒(NGF-NP)具有毒性低、生物相容性高、緩釋特性，可促進(jìn)PC12細(xì)胞及BMSCs存活、增殖和分化〔39，40〕。有研究將PEG-PLGA作為載體，包載NGF制備NGF-NP，其在體外可持續(xù)釋放NGF，56 d累積釋放60%左右。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NGF-NP可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖和分化。將這種納米粒聯(lián)合NSC移植治療AD模型大鼠，結(jié)果表明，與單純NSC移植相比，聯(lián)合移植組學(xué)習(xí)記憶能力改善更好，并且基底前腦膽堿能神經(jīng)元，海馬突觸數(shù)量明顯增加〔41，42〕。

這些結(jié)果提示，NGF納米遞送系統(tǒng)是目前彌補(bǔ)NGF在體內(nèi)應(yīng)用不足的關(guān)鍵治療策略。其所用的載體材料與制備工藝是影響NGF載藥量及遞送效率的關(guān)鍵，目前，在所有的遞送系統(tǒng)中納米粒因其控釋、緩釋，安全穩(wěn)定，穿透血腦屏障及細(xì)胞和組織相容性等優(yōu)點(diǎn)，成為研究最多的遞釋系統(tǒng)。研究表明，NGF-NP在體外能持續(xù)釋放NGF，釋放的NGF與包載前具有同樣的理化性質(zhì)，能夠促進(jìn)干細(xì)胞存活、增殖和分化。因此，NGF-NP聯(lián)合NSC移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可起到多重作用，持續(xù)釋放的NGF可以補(bǔ)充內(nèi)源性NT的不足，修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞；同時(shí)可促進(jìn)內(nèi)源性及外源性NSC分化為神經(jīng)元。

4 NSCs相關(guān)基因工程治療AD

NSCs具有遷移性，以NSCs為載體的基因治療可起到雙重作用：一方面NSCs可自我復(fù)制，使轉(zhuǎn)染的外源性基因不斷增加，并隨干細(xì)胞的遷移廣泛表達(dá)；另一方面，表達(dá)的外源性基因還可誘導(dǎo)自身干細(xì)胞定向分化，替代損傷的神經(jīng)細(xì)胞。外源性基因(如NT，代謝酶等基因)經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)染NSCs，使NSCs表達(dá)各種營養(yǎng)因子或酶，阻止神經(jīng)元變性死亡，或釋放所缺失的神經(jīng)遞質(zhì)，部分修復(fù)神經(jīng)環(huán)路。轉(zhuǎn)染hNGF的hNSC可以穩(wěn)定表達(dá)hNGF，并且表達(dá)量比對照組多近10倍，能夠抵抗過氧化氫(H2O2)、Aβ、鵝膏蕈氨酸的毒性反應(yīng)，保護(hù)NSC活性。將其移植治療鵝膏蕈氨酸誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷小鼠，可明顯提高學(xué)習(xí)記憶能力〔43〕。另有研究者利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將腦啡肽酶(一種Aβ降解酶)轉(zhuǎn)染至NSCs，使其表達(dá)并分泌腦啡肽酶，將這種干細(xì)胞移植到AD模型鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Aβ斑塊顯著減少并且突觸密度增加〔23〕。

此外，體外狀態(tài)下很難長時(shí)間維持原代NSCs存活，為了更好的研究NSCs的特性，人們通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)得到永生化NSCs系，為體外研究提供了更好的來源。Liu等〔44〕將表達(dá)NT的永生化C17-2 NSCs移植到PD大鼠模型紋狀體中，移植后C17-2 NSCs分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，并表達(dá)NT，發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)保護(hù)作用。但是，國內(nèi)研究者王彬等〔45〕將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)v-myc基因轉(zhuǎn)染人NSCs并進(jìn)行皮下移植，發(fā)現(xiàn)腫瘤形成。一些研究者認(rèn)為細(xì)胞轉(zhuǎn)染v-myc基因存在風(fēng)險(xiǎn)，這些細(xì)胞在發(fā)生永生化的同時(shí)也會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成〔46〕。所以，針對逆轉(zhuǎn)錄病毒將編碼癌基因蛋白的基因(如v-myc)轉(zhuǎn)染得到永生化的NSCs是否存在致瘤性的問題，仍需要大量研究。

5 問題與展望

近十幾年來，NSC移植治療AD取得了令人歡欣鼓舞的成績，但只停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，NSC移植治療AD患者鮮有報(bào)道。要想進(jìn)一步推進(jìn)臨床治療，還有大量工作亟待解決：① NSC移植方式、時(shí)間、移植細(xì)胞數(shù)目目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且僅有動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)。② 移植的NSCs雖然有遷移至Aβ區(qū)域的傾向，但仍無法抵達(dá)所有的損傷部位，如何誘導(dǎo)NSC靶向遷移？③ 靶區(qū)微環(huán)境可以影響NSC分化，分化過程的不同階段所需的分化因子不同，同一分化因子不同階段所需的濃度不同，如何定向誘導(dǎo)NSC分化為功能性神經(jīng)元？④ AD腦內(nèi)的病理變化如Aβ沉積、炎癥反應(yīng)均不利于外源性NSC存活，如何最大程度避免其損害？⑤ AD是一種多病因的神經(jīng)退行性疾病，在疾病某一階段聯(lián)合治療是否能取得更好的療效？⑥ NSC移植的長期療效及移植所帶來的副作用如何評(píng)價(jià)？這些問題需要進(jìn)一步解決。