辛暨麗 楊丹聃 張連芝 張紅 薛百功

(1吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021；2吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科)

以學(xué)生發(fā)展為中心，通過教學(xué)改革促進(jìn)學(xué)習(xí)革命，開放性實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高校素質(zhì)教育深化改革的重要課題〔1〕。進(jìn)化生物學(xué)在很多領(lǐng)域有效地解決了當(dāng)今重大疑難疾病治療的世界性難題，其廣泛地利用相鄰學(xué)科的成就，在技術(shù)方法上是博采眾長，因此十分適宜開放性實(shí)驗(yàn)教學(xué)〔2〕。讓學(xué)生在教師的指導(dǎo)下閱讀文獻(xiàn)、獨(dú)立設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、操作實(shí)驗(yàn)、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，幫助學(xué)生掌握科研技能，進(jìn)而形成嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)思維〔3〕。

1 實(shí)驗(yàn)方案的確定

在微生物進(jìn)化過程中，選擇壓力的存在可以保證微生物在與選擇壓力的相互作用下，菌種的隨機(jī)變異實(shí)現(xiàn)定向淘汰，與環(huán)境相適應(yīng)的基因型得以保存，特別是在人工選育過程中，通過人工施加定向的選擇壓力，使微生物沿著所需的方向的進(jìn)化，從而獲得目標(biāo)性狀的菌種。目前實(shí)驗(yàn)室最常用的適應(yīng)進(jìn)化方法是在特定條件(給予選擇壓力)下將微生物連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過菌株自發(fā)突變的不斷富集，獲得適應(yīng)特定條件的表型或生理性能。本實(shí)驗(yàn)預(yù)期將改良具有降解農(nóng)藥的菌株，以期獲得降解能力更強(qiáng)的菌株。適應(yīng)性進(jìn)化又稱定向進(jìn)化“實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化或馴化”，是目前備受矚目的菌種改良技術(shù)，能夠使菌株在較短的時(shí)間內(nèi)有效地改變菌株的某些表型或生理特性(如菌體生長速度，底物消耗速度，耐受高溫 高低pH值及不同有機(jī)溶劑等)，并且基本不會(huì)影響除目的表型外的其他優(yōu)良性狀〔4〕。采用分組制，每組4～5人，共分6～7組，每個(gè)小組由組長負(fù)責(zé)組織組員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的開展。學(xué)生在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下掌握查閱資料、確定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)踐操作、分析解決問題、撰寫論文的能力。

2 實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)過程

儀器包括超凈工作臺(tái)、搖床、培養(yǎng)箱、顯微鏡、分光光度計(jì)、滅菌鍋、恒溫干燥箱、恒溫水浴鍋、酸度計(jì)、離心機(jī)、移液器、培養(yǎng)皿、三角瓶、槍頭、各種培養(yǎng)基所需試劑，顯色試劑、菌種及農(nóng)藥底物。以泛氧副球菌為出發(fā)菌株，以O(shè),O-二甲基-O-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯(DDVP)為底物，添加濃度為最低抑菌濃度，添加時(shí)間為菌株的對數(shù)生長期，以1%的比例在液體培養(yǎng)基中不斷轉(zhuǎn)接，直至篩選出降解DDVP最高的菌株為止。①測得菌株最低抑菌濃度：菌株在最低抑菌濃度下，菌株突變率最高。通過測量OD值來確定最低抑菌濃度。隨著DDVP濃度增加，OD值逐漸降低，通過對不同濃度DDVP培養(yǎng)1 d，2 d，3 d，制得OD值與DDVP濃度曲線，3條曲線的第一個(gè)交點(diǎn)即為最低抑菌濃度。②菌株的生長曲線測定。OD值和培養(yǎng)時(shí)間制得曲線，曲線平緩之前即為最佳轉(zhuǎn)接時(shí)間。③進(jìn)行傳代培養(yǎng)：加入最低抑菌濃度的DDVP，并且測定DDVP降解率，得出最佳降解率及其所需要傳代時(shí)間(或傳代次數(shù))。④篩選：在降解率最高時(shí)，進(jìn)行涂布，平板劃線，單菌落篩選，逐一測定每株菌的DDVP降解率。⑤穩(wěn)定性的測定：對所得菌種進(jìn)行連續(xù)四至六代培養(yǎng)，隨后測定DDVP降解率。來確定降解率這一特性是否能穩(wěn)定遺傳。⑥菌種檢測：進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，活菌數(shù)的測定，菌活力檢測。⑦脅迫條件的改變：在進(jìn)行到第6步后，將得到的優(yōu)良菌種接種在新培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基除DDVP濃度增加，其余條件不變。⑧重復(fù)④～⑦步驟。直到篩選出能夠耐受最高DDVP濃度的菌株。⑨基因組測序分析。開放性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)。

3 效 果

在本實(shí)驗(yàn)中學(xué)生掌握了①設(shè)計(jì)適應(yīng)性進(jìn)化的環(huán)境條件；②掌握微生物降解磷的檢測方法；③掌握對進(jìn)化微生物的鑒定檢測方法；④分析原始菌株和進(jìn)化后菌株的比較分析。試驗(yàn)后各組需提交實(shí)驗(yàn)記錄和分析報(bào)告，總結(jié)實(shí)驗(yàn)中的收獲及存在的問題，指導(dǎo)教師根據(jù)反饋意見改進(jìn)實(shí)驗(yàn)。

綜上，我國高校人才培養(yǎng)重要目標(biāo)之一是培養(yǎng)創(chuàng)新型人才,推動(dòng)探究式學(xué)習(xí)，提高學(xué)生分析解決問題的能力，開放型實(shí)驗(yàn)為學(xué)生提供了一個(gè)開放、自由的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新能力、實(shí)踐能力和科學(xué)素養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)融合了細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)等多學(xué)科的原理和操作技術(shù)，切實(shí)提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)素質(zhì)和實(shí)操能力,培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)造性的科學(xué)思維和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)習(xí)態(tài)度,最大限度地利用實(shí)驗(yàn)室資源,充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室在實(shí)施素質(zhì)教育中的重要作用,使其更好地為學(xué)生服務(wù)。