張鴻飛，秦酈，蔣水星，畢付提，劉玲，張建華，王德培，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；4.山東日照金禾博源生化有限公司，山東日照276800）

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，在食品工業(yè)、精細(xì)化工洗滌和化妝品行業(yè)，醫(yī)藥業(yè)[1-4]等市場(chǎng)需求大，并以每年3%～5%需求量遞增。我國(guó)是檸檬酸生產(chǎn)大國(guó)，2017年產(chǎn)量達(dá)到152萬噸，是全球重要的檸檬酸生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。

目前檸檬酸發(fā)酵大都以玉米為原料，經(jīng)過高溫噴射液化，以帶渣玉米液化液為培養(yǎng)基進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)。由于每批玉米營(yíng)養(yǎng)成分存在很大差別，從而造成檸檬酸生產(chǎn)不穩(wěn)定；此外，帶渣玉米液化液黏稠溶氧較差，需加大通風(fēng)壓力，生產(chǎn)能耗大[5]；由于玉米渣中存在大量不被發(fā)酵利用的固形物，影響發(fā)酵過程精細(xì)控制，也造成提取相對(duì)困難。因此，帶渣玉米液化液發(fā)酵工藝亟待改變。以玉米清液進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。玉米粉液化去渣后，液化液中脂肪、蛋白質(zhì)含量低，發(fā)酵醪液黏度低利于溶氧，降低能耗縮短發(fā)酵周期，提高轉(zhuǎn)化率；發(fā)酵液固形物少，濾液清，油脂少，有利于從檸檬酸發(fā)酵液中提取檸檬酸，提高回收率和產(chǎn)品質(zhì)量；且液化后得到的濾渣可用于制備高品質(zhì)的玉米蛋白飼料[6]，增加企業(yè)經(jīng)濟(jì)收益。因此，進(jìn)行檸檬酸清液發(fā)酵新型工藝研究，降低檸檬酸生產(chǎn)成本，具有重大意義。

本論文以營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)穩(wěn)定的玉米液化清液為原料，確定了檸檬酸生產(chǎn)的最佳生產(chǎn)條件，并進(jìn)行中試生產(chǎn)，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

黑曲霉（Aspergillus.niger）CGMCC1042：由天津科技大學(xué)微生物保藏中心保藏。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、大豆蛋白胨 （分析純）：天津市北方天醫(yī)試劑公司；FeSO4（分析純）：天津市四通化工廠；肌醇（分析純）：上海權(quán)旺生物科技有限公司；玉米漿（試劑級(jí)）：金豐玉米有限公司；α-淀粉酶（40 000 U/mL）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯削皮切塊，稱取200 g，加入適量蒸餾水煮沸30 min，4層紗布過濾除渣，取清液加蒸餾水定容至1 L，加入2%葡萄糖充分溶解，加入瓊脂粉20 g，加熱充分溶解分裝斜面后，121℃，20 min滅菌。

玉米液化清液的制備：玉米粉與水以1∶4（g/mL）的比例混合，攪拌均勻后加熱到70℃，加入耐高溫的α-淀粉酶（0.5 kg/t），保溫10 min后加熱到90℃保溫4 h～5 h，趁熱經(jīng)兩層紗布過濾得糖化清液。過濾清液冷卻后加水調(diào)整總糖到要求的濃度[7]。

種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基：總糖10%的玉米液化清液，0.25%（NH4）2SO4，0.15%KH2PO4，500 mL 三角瓶裝液量 40 mL，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：總糖17%的玉米液化清液，0.2%KH2PO4，0.15%（NH4）2SO4，0.025%MgSO4，500 mL三角瓶裝液量50 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

OLYMPUS 719068光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA2004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DELTA320 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HZQ-QX恒溫振蕩器：中國(guó)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；WYT-J總糖計(jì)（0～32%）：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；HDL超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；30 L發(fā)酵罐：上海高機(jī)生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基有機(jī)氮源種類單因素試驗(yàn)

初糖濃度為17%的玉米液化清液添加0.15%（NH4）2SO4，在氮含量相同的前提下，以0.92%玉米漿、0.5%大豆蛋白胨、0.65%酵母粉、0.6%飼料蛋白作為有機(jī)氮源分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養(yǎng)72 h，每組做兩個(gè)平行試驗(yàn)，以最終產(chǎn)酸量及菌絲球形態(tài)為因變量，得出最佳的有機(jī)氮源并優(yōu)化其添加量。

1.3.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基添加玉米漿單因素試驗(yàn)

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在玉米液化清液中添加 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、1.2%、1.4%的玉米漿，另外添加0.15%（NH4）2SO4。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養(yǎng)72 h，每組做兩個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定最后的產(chǎn)酸量，確定玉米漿最終添加量。

1.3.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基添加（NH4）2SO4單因素試驗(yàn)

糖濃度為17%的玉米液化清液，分別添加0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%（NH4）2SO4。按 10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養(yǎng)72 h，每組做兩個(gè)平行，以最終產(chǎn)酸量為因變量，得出最佳的（NH4）2SO4添加量。

1.3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基添加肌醇單因素試驗(yàn)

糖濃度為17%的玉米液化清液，分別添加肌醇終濃度0、0.001%、0.003%、0.005%、0.007%、0.009%。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養(yǎng) 72 h，每組做兩個(gè)平行，以最終產(chǎn)酸量及菌絲球形態(tài)為因變量，得出最佳的肌醇添加量。

1.3.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)添加不同金屬離子正交試驗(yàn)

對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中 MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO46種金屬元素進(jìn)行L27（36）正交試驗(yàn)。按10%接種量，330 r/min，36.5℃，搖床培養(yǎng)72 h，每組做兩個(gè)平行，以最終產(chǎn)酸量為因變量，通過方差分析以確定6種金屬元素的最佳配比。正交試驗(yàn)因素及水平表見表1，正交試驗(yàn)因素的水平由單因素試驗(yàn)確定。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及水平Table 1 Levels of factors used in the orthogonal experimental design

1.3.2 玉米清液最佳發(fā)酵條件試驗(yàn)

1.3.2.1 初糖含量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響

調(diào)整玉米液化清液初糖濃度分別為16%、17%、18%、19%、20%，按10%的接種量，控制發(fā)酵溫度36.5℃，攪拌轉(zhuǎn)速 400r/min，通風(fēng) 400L/h，罐壓 0.1 MPa，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵開始每隔8小時(shí)分別從各個(gè)不同初糖濃度的發(fā)酵罐中取樣，測(cè)定檸檬酸產(chǎn)量和發(fā)酵液pH值，放罐后進(jìn)行菌絲體凈重測(cè)量，記錄凈重變化，以及殘還原糖測(cè)定。

1.3.2.2 種齡對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響

選取培養(yǎng) 18、20、24、27 h 的種子液進(jìn)行試驗(yàn)，接種量為10%，測(cè)定最終檸檬酸產(chǎn)量，放罐后進(jìn)行菌絲體凈重測(cè)量，記錄凈重變化以及殘還原糖測(cè)定。

1.3.2.3 溶氧對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響

采用30 L全自動(dòng)通風(fēng)機(jī)械攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度18%，調(diào)節(jié)初始pH 3.5。通風(fēng)量調(diào)整如下：

方案A分三段控制通氣量：0～16 h：300 L/h，轉(zhuǎn)速300 r/min；17 h～48 h：450 L/h，轉(zhuǎn)速 450 r/min～500 r/min；49 h～58 h：350 L/h，轉(zhuǎn)速 300 r/min。

方案B發(fā)酵全程大通風(fēng)量：0～60 h：450 L/h，轉(zhuǎn)速450 r/min～500 r/min；61 h～64 h：350 L/h，轉(zhuǎn)速 300 r/min。

1.3.2.4 檸檬酸產(chǎn)量的測(cè)定

取1mL發(fā)酵上清液于250mL三角瓶中，添加1滴～2滴酚酞做指示劑，用濃度為c的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡粉色，30 s后不褪色[85]，讀取消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶的體積為V，則檸檬酸產(chǎn)量計(jì)算公式為：

式中：Y為檸檬酸產(chǎn)量，以一水檸檬酸計(jì)量，g/100 mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)的量濃度，mol/L；V為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積，mL；0.142 9為滴定系數(shù)。

1.3.2.5 還原糖的測(cè)定

本試驗(yàn)采用費(fèi)林試劑熱滴定法，費(fèi)林試劑由甲、乙兩種溶液組成，滴定時(shí)以亞甲基藍(lán)為指示劑。

1）空白滴定

準(zhǔn)確吸取費(fèi)林試劑甲液和乙液各5 mL于250 mL錐形瓶中，滴加約19 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加熱使其在2 min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30 s，趁熱以每2秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積。平行操作3次，取其平均值V1。

2）發(fā)酵液還原糖的測(cè)定

樣品溶液測(cè)定：取費(fèi)林試劑甲液、乙液各5 mL，置于250 mL錐形瓶中，用移液管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋后發(fā)酵濾液0.1 mL置于錐形瓶中，加入2滴次甲基藍(lán)指示劑，從滴定管中加入比與測(cè)試樣品溶液消耗的總體積少1 mL的樣品溶液，加熱使其在2 min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30 s，趁熱以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄樣品溶液消耗的體積，平行操作3次，取其平均值V2，計(jì)算公式為：

式中：V為標(biāo)定時(shí)平均消耗還原糖樣品溶液的總體積，mL；N為還原糖樣品溶液的稀釋倍數(shù)；1 000為mg換算成g的系數(shù)。

1.3.2.6 產(chǎn)酸率的測(cè)定

式中：產(chǎn)酸率為檸檬酸生產(chǎn)速率，g/（100 mL·h）；Y為檸檬酸產(chǎn)量以一水檸檬酸計(jì)量，g/100 mL；t為發(fā)酵時(shí)間，h。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)氮源對(duì)檸檬酸清液發(fā)酵的影響

2.1.1 不同有機(jī)氮源種類的選擇

不同有機(jī)氮源[8]對(duì)黑曲霉檸檬酸發(fā)酵，菌絲球形態(tài)，糖酸轉(zhuǎn)化率等具有顯著的影響，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 不同有機(jī)氮源對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.1 The influence of different types of organic nitrogen sources on the production of citric acid

圖2 添加不同有機(jī)氮源發(fā)酵液菌絲球形態(tài)Fig.2 The mycelium pellet morphology after adding different organic nitrogen sources

由圖1可知，4種氮源對(duì)于產(chǎn)酸量的影響先后順序?yàn)橛衩诐{＞大豆蛋白胨＞蛋白飼料＞酵母粉，添加玉米漿時(shí)產(chǎn)酸量最高可達(dá)9.27 g/100 mL，糖酸轉(zhuǎn)化率均高于其它氮源，并且殘還原糖相對(duì)較少，大豆蛋白胨次之，添加玉米漿和大豆蛋白胨發(fā)酵性能優(yōu)于添加其他有機(jī)氮源。由圖2可知，添加玉米漿和大豆蛋白胨時(shí)的菌絲球形態(tài)較好，菌絲球大小較為均一，菌絲擴(kuò)散較少；添加酵母粉時(shí)的菌絲球形態(tài)不規(guī)則，且菌球直徑偏大；添加飼料蛋白時(shí)的菌絲球直徑一致性差，且菌絲擴(kuò)散較多。綜合以上產(chǎn)酸量、轉(zhuǎn)化率、殘還原糖以及菌球形態(tài)考慮，4種有機(jī)氮源中，玉米漿與大豆蛋白胨發(fā)酵性能最好，但從生產(chǎn)成本問題考慮，最終選取玉米漿為檸檬酸玉米清液發(fā)酵最適有機(jī)氮源。

2.1.2 玉米漿加入量的確定

2.1.1試驗(yàn)確定玉米漿為最佳有機(jī)氮源，玉米漿的濃度是關(guān)系檸檬酸是否能夠高效發(fā)酵的重要因素之一，通過測(cè)定最后的產(chǎn)酸量以及糖酸轉(zhuǎn)化率，確定玉米漿最適濃度。結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同玉米漿含量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.3 The influence of different corn syrup content on the production of citric acid

由圖3可知，當(dāng)玉米漿濃度為0.7%時(shí)黑曲霉產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率均最高，繼續(xù)增加玉米漿產(chǎn)酸量不再增加。綜合比較產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率指標(biāo)，選取0.7%玉米漿作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳有機(jī)氮源添加量。

2.2 不同濃度（NH4）2SO4對(duì)檸檬酸清液發(fā)酵的影響

研究表明[9]，在檸檬酸發(fā)酵過程中，添加一定量的（NH4）2SO4對(duì)檸檬酸產(chǎn)量有較明顯的提高。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.7%玉米漿后加不同終濃度的（NH4）2SO4，通過測(cè)定最后的產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率，從而確定玉米液化清液發(fā)酵培養(yǎng)基中（NH4）2SO4的最適濃度，結(jié)果如圖4。

圖4 不同（NH4）2SO4含量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.4 The influence of different（NH4）2SO4concentration on the production of citric acid

由圖4可知，發(fā)酵液中（NH4）2SO4的總濃度0.1%時(shí)，產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率均為最高。在添加其他濃度的（NH4）2SO4時(shí)，產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率均不理想，所以選擇0.1%作為（NH4）2SO4的最適總濃度。

2.3 不同濃度肌醇對(duì)檸檬酸清液發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的肌醇[10]，最終測(cè)定最后的產(chǎn)酸量并觀察菌絲球形態(tài)從而確定清液發(fā)酵培養(yǎng)基中肌醇的最適添加量，結(jié)果如圖5、圖6。

由圖5可知，從產(chǎn)酸量以及糖酸轉(zhuǎn)化率方面看，添加一定量的肌醇對(duì)提高產(chǎn)酸量有明顯作用，添加一定量肌醇的發(fā)酵產(chǎn)酸量均高于未添加肌醇的發(fā)酵產(chǎn)酸量，其中添加總濃度0.007%的肌醇時(shí)產(chǎn)酸量以及糖酸轉(zhuǎn)化率最高。從發(fā)酵完成后鏡檢圖6可知，未添加肌醇的菌絲球菌絲擴(kuò)散，菌絲球不致密，當(dāng)添加0.007%肌醇時(shí)，可明顯看出菌球纏繞的很緊密，向外伸展的菌絲較少，菌絲球形態(tài)規(guī)整，繼續(xù)增加肌醇濃度時(shí)，產(chǎn)酸量不再增加且菌絲球一致性下降，菌絲擴(kuò)散較多。綜合以上因素考慮選取0.007%的肌醇為最優(yōu)濃度。

圖5 不同肌醇含量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence of different inositol content on the production of citric acid

圖6 添加不同濃度肌醇發(fā)酵液菌絲球形態(tài)Fig.6 The mycelium pellet morphology after adding different content of inositol

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.4 6種金屬離子的濃度正交試驗(yàn)及驗(yàn)證

選取 MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4[11-12]多種濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表 2 可知，MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4這6個(gè)因素的不同水平中，通過極差分析可知，影響因子的主次順序?yàn)椋篊aCl2＞MgSO4＞KCl＞FeSO4＞ZnSO4＞CuSO4，最優(yōu)組合為 A1B1C1D1E1F3，優(yōu)化后的最優(yōu)濃度：MgSO40.1 g/L，CuSO40.8 mg/L，ZnSO40.02 g/L，CaCl22.0 g/L，KCl 0.1 g/L，F(xiàn)eSO40.34 mg/L。

在最優(yōu)濃度培養(yǎng)條件下，對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，500 mL三角瓶裝液量 50 mL，36.5℃，330 r/min進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵72 h。驗(yàn)證結(jié)果產(chǎn)酸量為9.96 g/100 mL，高于正交試驗(yàn)中任何一組產(chǎn)酸量，驗(yàn)證了最佳組合的優(yōu)勢(shì)效應(yīng)。

續(xù)表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.5 玉米液化清液最佳發(fā)酵條件

2.5.1 不同初糖濃度對(duì)檸檬酸清液發(fā)酵的影響

選取不同初糖濃度玉米液化清液發(fā)酵進(jìn)行發(fā)酵后，測(cè)定檸檬酸產(chǎn)量，殘還原糖及固形物含量，結(jié)果見表4。

由表4可知，當(dāng)初糖濃度為18%時(shí)發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)酸量最高，糖酸轉(zhuǎn)化率最高，且殘還原糖濃度處于較低水平。由放罐后固形物含量可知，當(dāng)初糖濃度18%以上時(shí)，固形物含量明顯升高，考慮到發(fā)酵液固形物含量對(duì)下游提取的影響，綜合以上因素，最終選取18%初糖濃度進(jìn)行下一步研究。

2.5.2 種齡對(duì)檸檬酸清液發(fā)酵的影響

接種不同種齡的種子液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定最終檸檬酸產(chǎn)量，殘還原糖并記錄相應(yīng)發(fā)酵周期，結(jié)果見表5。

表4 發(fā)酵結(jié)束檸檬酸產(chǎn)量Table 4 The production of citric acid at the end of fermentation

表5 種齡對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響Table 5 The effect of different inoculation time on citric acid fermentation

由表5可知，隨著種齡的增大，檸檬酸酸產(chǎn)量逐漸增大，其中菌齡27 h時(shí)產(chǎn)酸量最高，因此選擇種齡27 h為黑曲霉菌種最佳移種時(shí)間。

2.5.3 不同工藝控制對(duì)檸檬酸清液發(fā)酵的影響

不同工藝控制，使發(fā)酵過程發(fā)酵液中溶氧濃度差異較大，而溶氧濃度[13-17]對(duì)檸檬酸發(fā)酵有極大的影響。從發(fā)酵開始每隔8小時(shí)取樣，測(cè)定發(fā)酵液中檸檬酸濃度、pH值的變化情況，每隔1小時(shí)記錄溶氧。結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 不同工藝發(fā)酵檸檬酸溶氧曲線Fig.7 Different process fermentation citric acid dissolved oxygen curve

圖8 不同工藝對(duì)8 h檸檬酸積累的影響Fig.8 The influence of different processes on accumulation of citric acid for 8 hours

由圖7可知，0～16 h時(shí)，大通風(fēng)量溶氧優(yōu)于分段通風(fēng)；16 h～64 h時(shí)，方案A溶氧高于方案B。結(jié)合圖8來看，方案B中，發(fā)酵前期溶氧過高，易引起菌體增殖過剩，導(dǎo)致黑曲霉過早進(jìn)入檸檬酸累積期，pH值下降過快。低pH值會(huì)影響糖化酶活性，進(jìn)而影響原料的利用率，使發(fā)酵液殘還原糖含量過高，故發(fā)酵后期方案B產(chǎn)酸量不如方案A。最終選取方案A三段式通風(fēng)量進(jìn)行下一步研究。

分段通風(fēng)對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響見圖9。

由圖9可知，在發(fā)酵前期（0～16 h）控制通風(fēng)量為300 L/h，菌體大量增殖，代謝正常，發(fā)酵液pH值為3.5，該pH值有利于保持發(fā)酵液糖化酶活力，使還原糖含量上升，發(fā)酵16 h之后黑曲霉進(jìn)入快速產(chǎn)酸量期，17 h～48 h通風(fēng)量調(diào)整為450 L/h，轉(zhuǎn)速450 r/min～500 r/min，此時(shí)黑曲霉菌絲球代謝更加旺盛，更多的還原糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸，此時(shí)還原糖含量開始大幅度下降，產(chǎn)酸量開始大量增加；48 h以后接近發(fā)酵結(jié)束，49 h～58 h通風(fēng)量調(diào)整為：通風(fēng)350 L/h，轉(zhuǎn)速300 r/min，此時(shí)還原糖處于較低水平，溶氧較高，pH值相對(duì)穩(wěn)定，可降低通風(fēng)和轉(zhuǎn)速。在58 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，檸檬酸產(chǎn)量為18.33 g/100 mL，糖酸轉(zhuǎn)化率為101.8%，殘還原糖量為0.5%。而相同發(fā)酵工藝玉米帶渣發(fā)酵液發(fā)酵水平17.5 g/100 mL，轉(zhuǎn)化率99.5%，此清液發(fā)酵水平已高于帶渣發(fā)酵產(chǎn)量水平。

圖9 分段通風(fēng)對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響Fig.9 The effect of segmented ventilation on citric acid fermentation

3 結(jié)論

本研究對(duì)玉米液化清液發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過對(duì)氮源，營(yíng)養(yǎng)因子，金屬離子的多次單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：玉米清液糖濃度為18%，玉米漿0.7%，（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO40.1 g/L，CuSO40.8 mg/L，ZnSO40.02 g/L，CaCl22.0 g/L，KCl 0.1 g/L，F(xiàn)eSO40.34 mg/L，肌醇0.007%。在種齡27h，分段通風(fēng)轉(zhuǎn)速控制的發(fā)酵條件下，發(fā)酵周期為60 h，檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到18.33 g/100 mL，糖酸轉(zhuǎn)化率為101.8%，殘還原糖量為0.5%，而相同發(fā)酵工藝玉米帶渣發(fā)酵液發(fā)酵水平17.5 g/100 mL，轉(zhuǎn)化率99.5%，由此，玉米清液發(fā)酵有望成為檸檬酸新型發(fā)酵方式。