β樣淀粉蛋白和早老素增強子-2與環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答原件結(jié)合蛋白的關(guān)系

邸暢 李國萍 陳紹春，3

(昆明醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，云南 昆明 650500；2第三附屬醫(yī)院頭頸外科；3康復(fù)學(xué)院)

β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是阿爾茨海默病(AD)公認的一個病理學(xué)改變也是診斷依據(jù)之一。γ分泌酶是產(chǎn)生Aβ的最后剪切蛋白復(fù)合體，它剪切生成的Aβ主要為Aβ40和Aβ42。而比較認可的形成Aβ沉積的原因就是Aβ40和Aβ42比例的失調(diào)。γ分泌酶中起主要催化作用的部分是早老素(PS)-1，而早老素增強子(Pen)-2主要作用就是使PS-1內(nèi)分解，對底物的催化作用產(chǎn)生影響。環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答原件結(jié)合蛋白(CREB)是與長期記憶和基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的一種蛋白，單體Aβ42可以促進其生成，而CREB本身可以調(diào)節(jié)Pen-2表達。本文就Aβ的形成意義、CREB的前后作用、Pen-2的功能對三者間的關(guān)系進行綜述。

1 Aβ的形成

淀粉樣前體蛋白(APP)在經(jīng)過β分泌酶切割的情況下形成99個氨基酸的肽鏈(C99),C99在γ分泌酶剪切后形成Aβ40和Aβ42，Aβ40和Aβ42的區(qū)別在于Aβ42羧基端多了2個疏水鍵，導(dǎo)致Aβ42更容易積聚沉積形成淀粉樣斑塊〔1〕。在腦中形成的Aβ斑塊會對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用導(dǎo)致神經(jīng)損傷甚至腦萎縮，而Aβ寡聚體很可能是淀粉樣斑塊的前體〔2〕。Aβ寡聚體可能通過降低CREB靶基因和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達而損害AD中的神經(jīng)元功能。恰恰相反的是新的研究發(fā)現(xiàn)Aβ42單體可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路誘導(dǎo)分化型人神精母細胞瘤和元代大鼠皮層神經(jīng)中CREB的激活,而Aβ42寡聚體沒有這個影響,反而在大鼠模型和AD患者中CREB的表達受損〔3〕。這說明單體和寡聚體之間的轉(zhuǎn)變是毒性作用產(chǎn)生的原因。Aβ40與Aβ42的比例失常被認為是導(dǎo)致淀粉樣沉淀的原因，Aβ40在AD發(fā)病機制中具有保護作用。雖然已知Aβ40能抑制Aβ42纖維的形成，但尚不清楚這種抑制作用是對無毒單體起作用，還是對毒性寡聚體起作用。有研究通過核磁信號來監(jiān)測Aβ42和Aβ40單體的變化，差異核磁共振同位素標記可以選擇性地觀察Aβ42在Aβ42和Aβ40混合物中的聚集狀況〔4〕。Aβ40單體通過Aβ42/Aβ40比例依賴的方式抑制無毒Aβ42單體的聚集。核磁共振測定表明，Aβ40單體與Aβ42寡聚體的結(jié)合比Aβ42單體具有更高的親和力。Aβ40還可以從Aβ42寡聚體中釋放Aβ42單體〔4〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成纖維的Aβ分子不斷地解離和再結(jié)合，從而導(dǎo)致纖維群內(nèi)的分子循環(huán)〔2〕。對Aβ40和Aβ42的研究表明，構(gòu)成Aβ40的分子比Aβ42的再循環(huán)程度要大得多〔2〕。這在側(cè)面也說明了Aβ40在與Aβ42的作用中起到一個保護Aβ42不聚集沉積的作用，當這種比例失調(diào)發(fā)生的時候單體Aβ40的量不能維持可以使單體Aβ42游離的程度，Aβ的寡聚體就形成了，而惡性循環(huán)下毒性斑塊的形成也只是時間問題。Aβ42有4種形態(tài)，分別為單體、寡聚體、原纖維和纖維，其中Aβ42單體和纖維是沒有神經(jīng)毒性的，寡聚體的毒性最大，原纖維的毒性反而降低〔5〕。在過去的研究中有針對小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞對Aβ寡聚體吞噬的研究，筆者推斷正常情況下當Aβ42寡聚體形成過多時被小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞吞噬是正常的代謝過程。而上述的膠質(zhì)細胞對纖維的吞噬能力比對寡聚體的吞噬能力弱得多，即當Aβ寡聚體形成過量而無法代謝時，沉淀形成斑塊的可能性將大幅增加。

2 CREB

CREB在大腦中的所有細胞中都有表達，CREB最著名的是它參與學(xué)習(xí)和長期記憶的形成，是作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)家族中的一員。轉(zhuǎn)錄因子(如CREB)對刺激轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)起著至關(guān)重要的作用。將發(fā)生在細胞膜上的事件傳遞給基因表達的改變。反過來，改變基因表達，通過調(diào)節(jié)幾乎所有類型的神經(jīng)元蛋白的表達，最終會影響單個神經(jīng)元和整個神經(jīng)元回路的功能。CREB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟包括二聚，與DNA中的反應(yīng)元件結(jié)合及磷酸化。近年來的研究表明，老年人非病理性記憶障礙與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有關(guān)〔6〕。CREB轉(zhuǎn)錄因子家族的成員包括轉(zhuǎn)錄增強子(如CREB1)和抑制子(如CREB2)，并與許多信號蛋白相互作用，介導(dǎo)從短期記憶到長期記憶的轉(zhuǎn)變。用定量Western印跡法測定6月齡和24月齡大鼠海馬勻漿中CREB1和CREB2的含量，根據(jù)空間記憶能力，將老年大鼠分為兩組：年齡無損傷大鼠(AU)在青年(Y)得分的范圍內(nèi)，而老年受損大鼠(AI)的范圍內(nèi)得分不在該范圍〔6〕?？傮w而言，老年大鼠CREB1蛋白明顯低于青年大鼠。實驗分析表明，這一差異是由于老年損傷大鼠的CREB1水平顯著下降，而老年未受損大鼠的CREB1水平與年輕大鼠相當，幼年大鼠和老年大鼠CREB2蛋白水平無明顯變化〔6〕。這些結(jié)果表明CREB1蛋白的調(diào)控失調(diào)可能是導(dǎo)致部分老年人空間記憶障礙的原因之一。另有研究〔7〕絲氨酸(Ser)133上轉(zhuǎn)錄因子CREB的磷酸化參與了海馬依賴任務(wù)的長期記憶的建立，大鼠接受海馬內(nèi)輸注單純皰疹病毒(HSV)-mCREB(一種突變型CREB，其中Ser133已被丙氨酸取代)、HSV-β半糖苷酶結(jié)構(gòu)基因(Lacz)或生理鹽水，3 d后接受訓(xùn)練。訓(xùn)練后立即短期試驗和11 d長期試驗檢測大鼠的食物偏好(示范食物與新型食物)。在短期記憶測試中，所有治療組的大鼠對已證實的食物有明顯的偏好。然而，在長期記憶測試中，經(jīng)mCREB處理過的大鼠所吃食物的百分比明顯低于經(jīng)Lacz或鹽水處理的大鼠。定量Western印跡證實mCREB注入大鼠訓(xùn)練組的海馬CREB蛋白含量明顯高于對照組〔7〕。接下來的研究中通過病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄來增加海馬背側(cè)的CREB水平，在水迷宮實驗中與鹽水組和Lacz組相比增加海馬背側(cè)CREB表達組長期記憶明顯增強，需要記住的時間明顯縮短〔8〕。在紋狀體中增加突變CREB的表達與鹽水組和Lacz組相比并沒有同樣的反映記憶時間上的節(jié)省，說明背側(cè)紋狀體在反應(yīng)記憶的形成中起重要作用〔9〕。BDNF是CREB轉(zhuǎn)錄表達后的產(chǎn)物，已被證明是長期記憶產(chǎn)生的一個關(guān)鍵因素。在海馬背側(cè)CA1區(qū)注射重組BDNF可逆轉(zhuǎn)局部抑制蛋白質(zhì)合成所造成的記憶持續(xù)缺陷。重要的是，BDNF能夠通過一種胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)依賴機制將一條永久的長期記憶軌跡轉(zhuǎn)化為一種持久的記憶軌跡，從而誘導(dǎo)記憶的持久性。BDNF不僅是必需的，而且足以在海馬內(nèi)誘發(fā)一個后期的記憶處理階段，這對于長期記憶儲存的持續(xù)存在是必不可少的〔10〕。在AD模型Tg2576基因突變小鼠腦組織免疫組化分析顯示海馬和皮層CREB水平降低，轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中檢測到氧化應(yīng)激標記物，顯示星形膠質(zhì)細胞豐富的區(qū)域CREB染色減少〔11〕。在AD患者病死后海馬標本中，十二烷基硫酸鈉(SDS)提取的Aβ與CREB蛋白水平也呈負相關(guān)〔11〕。CREB調(diào)控的BDNF和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)抑制劑BIRC-3的水平降低，Caspase-9的活性裂解形式(凋亡的內(nèi)在途徑)升高。大鼠原代海馬神經(jīng)元暴露于Aβ纖維后，CREB啟動子活性降低?？寡趸瘎㎞-乙酰半胱氨酸可逆轉(zhuǎn)Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元CREB mRNA水平下降。腺病毒介導(dǎo)CREB過度表達對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡有明顯的保護作用〔11〕。也就是說長期記憶形成的部位是在Aβ斑塊沉積易形成的海馬區(qū)，而CREB的生成可以被單體Aβ42所激活，Aβ的寡聚體可降低CREB的表達。

3 Pen-2

Pen-2是組成γ分泌酶復(fù)合體的一部分，與Ps-1、呆蛋白(Nct)、前咽缺陷蛋白(Aph)-1行成復(fù)合體，在Aβ的形成和Notch刻痕信號通路中起作用〔12〕。γ分泌酶起催化作用的主要部分是Ps-1，也是γ分泌酶抑制劑的主要作用部位〔13〕。而Nct除了支持和穩(wěn)定作用外還能對γ分泌酶切割的底物起識別作用。但是當敲除Nct的情況下γ分泌酶的功能不受影響，也說明了Nct在γ分泌酶中不是必需的〔14〕。值得注意的是，PEN-2的羧基端親水結(jié)構(gòu)域可以促進Ps-1的內(nèi)源性水解，但對穩(wěn)定Ps-1的衍生物至關(guān)重要。更重要的是，由甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1中的跨膜區(qū)(TMD)1取代Pen-2的TMD2的嵌合是完全有功能的，而用SREBP-1中的TMD2替換Pen-2的TMD2的嵌合則不是這樣。后一種嵌合體的功能是通過將SREBP-1的TMD2近端2/3替換為PEN-2中真實的TMD1的近端2/3來挽救的。這些結(jié)果表明，近端2/3的Pen-2 TMD1在功能上對Ps-1全蛋白的內(nèi)源性分解和Ps-1片段的產(chǎn)生具有重要的作用〔15〕。在一定的PS1、N端氨基端(NTF)/C端羧基端(CTF)表達水平下，Aβ的產(chǎn)生是可飽和的，而Pen-2的過度表達則進一步增加了Aβ的產(chǎn)生。雖然Pen-2并不能促進PS1-NTF/CTF異二聚體的形成，但PEN-2的表達降低了一種過渡態(tài)類似物γ-分泌酶抑制劑的半抑制率(IC50)，表明Pen-2的表達增強了底物與催化位點的親和力或降低了閾值〔16〕。有研究對人源Pen-2基因的上游區(qū)域進行了鑒定，并將位于翻譯起始密碼子上游353 bp的238 bp片段作為啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CREB結(jié)合位點位于238 bp區(qū)域，該區(qū)域?qū)en-2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要。CREB位點突變阻斷了Pen-2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。電泳遷移率測定和染色質(zhì)免疫共沉淀分析表明，CREB在體外和體內(nèi)均與Pen-2啟動子區(qū)結(jié)合。用CREB激動劑福斯克林(Forskolin)激活CREB轉(zhuǎn)錄因子可顯著促進Pen-2 mRNA和蛋白的表達，而對γ-分泌酶復(fù)合物的其他組分沒有影響〔17〕。當Ps-1基因突變導(dǎo)致Ps-1和Pen-2聯(lián)系減少但不影響γ分泌酶功能和Ps1內(nèi)分解時，Aβ42∶Aβ40比例升高且不影響Notch信號通路，即當Pen-2表達量降低時Aβ42∶Aβ40升高〔18〕。而在癡呆小鼠模型中使用γ分泌酶抑制劑時加重了小鼠的記憶障礙，這也從側(cè)面說明了Aβ42可能在記憶形成中具有重要作用〔19〕。在過去的報道中有研究通過構(gòu)建一個攜帶人源PEN-2的雜交基因，并將其用于人神經(jīng)上皮細胞的轉(zhuǎn)染，該細胞還與突變體早老素2(hPS2m)和瑞典突變型Aβ前體蛋白(APPsw)共轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明：(1)人源PEN-2過表達可引起γ分泌酶活性及其蛋白(包括Ps1-CTF、Aph-1和Nct)的增加，從而產(chǎn)生Aβ42的量增加；(2)與hPS2m和APPsw共轉(zhuǎn)染對γ分泌酶蛋白的誘導(dǎo)和活性的影響并與單獨轉(zhuǎn)染hPen2相比作用差異不大；由此可見底物和催化活性對于Aβ42的產(chǎn)生并不是必須的〔20〕。但Aβ42的增加作者并未說明Aβ40的變化，而Aβ42與Aβ40的比例變化對Aβ寡聚體和淀粉樣沉積的形成有重要意義。綜上所述，突變激活Pen2上游CREB結(jié)合位點時可增加Pen2蛋白和mRNA的表達，過表達Pen2可增強γ分泌酶及Aβ42的表達，而PS-1及Pen-2的聯(lián)系減少時即Pen-2表達降低時Aβ42∶Aβ40增加，可以看出Pen2對Aβ42和Aβ40的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)的作用，但是當Pen-2增加時對Aβ42∶Aβ40是未知的，此時雖然Aβ42的量增加但不能說明比例是否失衡及有無淀粉樣蛋白的產(chǎn)生。

4 總結(jié)和展望

綜上，當CREB的表達下降，Pen-2的表達量將受到直接的影響隨之下降，Aβ42與Aβ40的比例增加。當Aβ40單體的量不足以維持Aβ42單體形式，產(chǎn)生Aβ寡聚物甚至沉積而導(dǎo)致CREB的表達進一步受損，形成一個正反饋的閉環(huán)。值得繼續(xù)研究的是，當Pen-2表達量增加時隨之增加的Aβ42是否同時伴隨著更多的Aβ40的增加、而Aβ40的增加能否真正有效可觀的減少Aβ寡聚體甚至沉淀的形成是未來要研究及努力的方向。