姚麗萍， 陳紫薇， 張曉梅， 許正宏*， 陸茂林

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省微生物研究所有限公司，江蘇 無錫 214063）

L-絲氨酸 （L-serine）是人類非必需氨基酸之一，主要應用于醫(yī)藥、化工及食品等多種相關領域。此外，L-絲氨酸作為生物體內重要的一碳單位，是嘧啶、嘌呤等有機物的主要供體[1-2]。L-絲氨酸具有廣泛的市場前景及開發(fā)潛力[3]。

目前，L-絲氨酸生產方法主要有化學合成法、蛋白水解法及微生物發(fā)酵法等[4-8]。其中，微生物發(fā)酵法與化學合成法及蛋白水解法相比，具有綠色環(huán)保、高效、產物易分離提取等優(yōu)點[3]。近年來，微生物直接發(fā)酵法生產L-絲氨酸的研究主要集中在大腸桿 菌 （Escherichia coli） 及 谷 氨 酸 棒 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）上[9-12]。 谷氨酸棒桿菌SYPS-062 33a ΔSSA-PS是本實驗室經代謝改造構建的能發(fā)酵蔗糖高產L-絲氨酸的菌株，其利用全合成培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵120 h，L-絲氨酸產量達25.31 g/L。利用廉價原料發(fā)酵一直是生物工程領域的研究熱點[13-14]，糖蜜作為制糖工業(yè)的副產物，含有大量可發(fā)酵糖類，同時含有大量的微生物生長所需的微量營養(yǎng)物質，且價格低廉，可作為微生物發(fā)酵的替代原料。Wang等[15]利用Bacillus sp.XZL9發(fā)酵糖蜜可以獲得74.7 g/L的乳酸；Kotzamanidis等[16]以糖蜜為原料，利用Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130發(fā)酵生產乳酸，產量達88.0 g/L；Xu等[17]以糖蜜為原料，利用Corynebacterium glutamicum發(fā)酵產L-賴氨酸，產量達34.5 mmol/L。但在將糖蜜作為微生物發(fā)酵原料時，需進行預處理，以去除其中可能影響微生物發(fā)酵的膠體、鈣質、灰分等[18-19]。

本文考察了不同的糖蜜預處理方法、添加量對谷氨酸棒桿菌SYPS-062 33a ΔSSA-PS生長及產L-絲氨酸的影響，并初步探討了糖蜜對絲氨酸合成相關途徑中關鍵酶基因轉錄水平的影響，為該菌株高效發(fā)酵生產L-絲氨酸奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗糖蜜：由山東正信集團提供，總糖量48.20%。

重組谷氨酸棒桿菌（Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSA-PS）為江南大學藥學院制藥工程研究室構建并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：

A：無水葡萄糖 20，115℃，7 min進行滅菌。

B：BHI 37， （NH4）2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.2，NaH2PO40.3，自然 pH，115 ℃，7 min 進行滅菌。

A+B混勻使用。

發(fā)酵全合成培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 100，（NH4）2SO430，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，原兒茶酸 0.03，生物素 0.5×10-3，硫酸硫胺素 4.5×10-3。滅菌條件：115 ℃，7 min。添加糖蜜時，通過換算隨后替代蔗糖加入或者添加一定量的糖蜜，定容，分裝，滅菌。

1.2 糖蜜預處理方法

1.2.1 EDTA法 糖蜜預先加水稀釋成質量比為1∶1的混合溶液，用1 mol/L的HCl調pH至7.0，于沸水中加熱30 min，加入質量分數(shù)100×10-6的EDTA以加速重金屬物質的沉積。將混合物于室溫下靜置24 h，然后12 000 r/min離心20 min，取上清進行下一步實驗。

1.2.2 硫酸法 糖蜜預先加水稀釋成質量比為1∶1的混合溶液，用1 mol/L的H2SO4調pH至3.0。將混合物于室溫下靜置24 h，然后12 000 r/min離心20 min，取上清。將上清用10 mol/L的NaOH調pH至5.5，取上清進行下一步實驗。

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1.2.3 磷酸法 糖蜜預先加水稀釋成質量比為1∶1的混合溶液，用1 mol/L的H2PO4調pH至3.0。于沸水中加熱30 min，將混合物于室溫下靜置24 h，然后12 000 r/min離心20 min，取上清。將上清用10 mol/L 的 Ca（OH）2調pH 至 5.5，12 000 r/min 離心30 min，取上清進行下一步實驗。

1.2.4 活性炭法 糖蜜預先加水稀釋成質量比為1∶1的混合溶液，于60℃下靜置24 h，經活性炭吸附處理后，12 000 r/min離心30 min，上清進行抽濾，除雜，濾液進行下一步實驗。

1.2.5 澄清法 糖蜜預先加水稀釋成質量比為1∶1的混合溶液，利用聚丙烯酰胺（PAM）作為糖蜜預處理的澄清劑，于100 mL的糖蜜溶液中分別加入5 mL的21.9 g/L乙酸鋅溶液和10.6%的亞鐵氰化鉀，于室溫下靜置過夜，促進澄清劑沉積?；旌衔镉?2 000 r/min離心20 min，取上清進行下一步實驗。

1.2.6 陽離子交換樹脂法 糖蜜預先加水稀釋成質量比為1∶1的混合溶液，100 mL糖蜜溶液中加入20 g陽離子交換樹脂，混合體系于恒溫振蕩器中，250 r/min，30 ℃振蕩 6 h，12 000 r/min離心 20 min，上清用10 mol/L NaOH調pH至5.5，取上清進行下一步實驗。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 發(fā)酵前處理 分別測定原糖蜜及不同預處理后的糖蜜的總糖含量，調總糖含量至10%。

1.3.2 谷氨酸棒桿菌活化 甘油管接種劃線于固體種子培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)3～4 d。

1.3.3 種子培養(yǎng) 接種一環(huán)平板種子于液體種子培養(yǎng)基，30℃，120 r/min培養(yǎng) 28 h，使其 OD562=25。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，使其初始 OD562=1，30 ℃，120 r/min培養(yǎng) 120 h，每 12 h取一次樣，進行數(shù)據(jù)測定。

1.4qRT-PCR

RNA提取采用RNA抽提試劑盒 （上海生工生物有限公司）；逆轉錄和qRT-PCR分別采用RayScriptcDNA SynthesisKit和 PowerqPCR PreMix試劑盒（上海捷瑞生物公司）。

選擇16s（RNA）作為內參基因，并設計相應的擴增引物。根據(jù)C.glutamicum ATCC 13032的基因序列，使用DNAMEN軟件設計EMP途徑相關基因的引物，如表1所示。

1.5 分析方法

生物量測定：取100 μL發(fā)酵液用1 mol/L HCl稀釋到適宜質量濃度，利用分光光度計于波長562 nm處測定。

氨基酸含量和糖濃度的測定：將不同時間的發(fā)酵液于4℃、14 000 r/min離心10 min，上清液用于氨基酸含量和糖濃度的測定。發(fā)酵液中蔗糖和果糖及氨基酸含量均采用HPLC測定[20-21]。糖蜜中總糖和葡萄糖含量采用菲林試劑法測定[19]。

表1 相關基因的引物Table 1 Primers list

2 結果與分析

2.1 預處理方法對糖蜜中總糖含量的影響

糖蜜作為制糖工業(yè)的副產物，可作為微生物發(fā)酵的替代原料[19]。作為微生物發(fā)酵原料時，糖蜜需進行預處理，去除其中的膠體、鈣質、灰分等。不同的預處理方法使得糖蜜組分及含量具有一定的差異。采用不同方法對糖蜜進行預處理，預處理前后糖蜜中的總糖和葡萄糖含量如表2所示。糖蜜采用硫酸預處理后，促使多糖水解形成單糖形式，菌體可直接利用葡萄糖含量比預處理前增加了4.51倍。采用活性炭法、澄清法和陽離子交換樹脂法對糖蜜進行預處理后，總糖及葡萄糖含量與未處理時變化不大。采用磷酸預處理糖蜜可去除大量的灰分和膠體成分，去除雜質較徹底，但同時也損耗了大量的糖類物質，與余煒等[18]研究結果一致。

2.2 糖蜜代替蔗糖為碳源對重組谷氨酸棒桿菌生長及L-絲氨酸生產的影響

搖瓶發(fā)酵考察糖蜜對重組菌生長及生產L-絲氨酸的影響，以總糖為10%的糖蜜代替全合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖為碳源進行發(fā)酵性能測定，實驗結果如表3所示。采用硫酸法、EDTA法和澄清法預處理的糖蜜對重組菌的菌體生長較為有利，而磷酸法和樹脂法處理的糖蜜則對其生長不利。但所有預處理后的糖蜜作為唯一碳源時均不利于該重組菌積累L-絲氨酸。總體而言，硫酸法處理的糖蜜對重組菌生長和產酸較好。以糖蜜為原料時，谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產賴氨酸也有相似的結果[19]。

表2 不同方法處理后糖蜜中糖類含量變化Table 2 Concentration of sugar by different methods of molasses

表3 不同預處理方法對重組菌株生長及L-絲氨酸產量的影響Table 3 Effects of different methods of molasses on cell growth and L-serine production

2.3 糖蜜的添加量對重組菌株谷氨酸棒桿菌生長及L-絲氨酸生產的影響

進一步考察了硫酸法預處理的糖蜜的不同添加量對重組菌生長及L-絲氨酸生產的影響，結果如表4所示。蔗糖中添加少量糖蜜有利于菌株生長和產物積累，當培養(yǎng)基中糖蜜的糖量為1%，蔗糖量為9%時為最好。這可能是由于糖蜜中含有的多種營養(yǎng)因子（生物素、維生素等可在一定的質量分數(shù)范圍內促進微生物生長和產物合成。

進一步考察了低質量分數(shù)糖蜜對重組菌生長和L-絲氨酸生產的影響，結果如圖1所示。當全合成培養(yǎng)基中添加糖蜜總糖量為0.24%的硫酸預處理糖蜜時，重組菌生物量最高，OD562可達76.37，且L-絲氨酸產量最高，可達32.76 g/L，糖酸轉化率為0.33 g/g（表5），比對照組提高了29.44%。上述結果充分說明了糖蜜在該重組菌生長和產物合成中更多發(fā)揮了促進劑的作用，而非作為碳源。

表4 糖蜜和蔗糖為混合碳源對菌株生長和L-絲氨酸產量的影響Table 4 Effects of the carbon of molasses and sucrose on cell growth and L-serine production

圖1 低質量濃度糖蜜添加對菌體生長和L-絲氨酸產量的影響Fig.1 Effects of different molasses addition on cell growth and L-serine production

表5 糖蜜添加量對菌體糖酸轉化率和生產強度的影響Table 5 Effects ofdifferentmolassesaddition on productivity and yield of L-serine

在全合成培養(yǎng)基和添加總糖為0.24%的硫酸預處理糖蜜后的發(fā)酵過程結果表明（圖2），添加少量的糖蜜對菌株生長的遲滯期無明顯影響，發(fā)酵至84～120 h時，菌株的生長速度較對照組好，發(fā)酵至120 h時，實驗組OD562可達76.37，較對照組提高了23.82%；L-絲氨酸產量可達32.76 g/L，較對照組（25.31 g/L）提高了 29.44%。

圖2 重組菌在不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵過程Fig.2 Fermentation process of different mediums by the recombinant strain

2.4 糖蜜對EMP途徑相關基因轉錄水平的影響

谷氨酸棒桿菌以蔗糖為碳源，經糖酵解（EMP）途徑，以3-磷酸甘油酸為前體合成L-絲氨酸。EMP途徑與菌體生長有密切關系，實驗表明微量糖蜜的添加對菌體生長和積累L-絲氨酸均有促進作用，為此考察了添加總糖量為0.24%的糖蜜 （不同預處理方法）對EMP途徑相關基因轉錄水平的影響，結果如圖3所示。添加少量添加糖蜜可促進EMP途徑中相關酶基因的轉錄水平，這可能是促進產物積累的主要原因之一。在實驗組（糖蜜處理方法：未處理、活性炭法、硫酸法）中，甘油酸激酶的編碼基因pgk的轉錄水平提高最顯著，分別提高了2.68、7.11和9.83倍。在實驗組（糖蜜處理方法：澄清法、磷酸法、陽離子交換樹脂法）中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因gap的轉錄水平提高最顯著，分別提高了5.67、7.05和3.34倍。EMP途徑的上調可能是由于糖蜜中含有大量的有機酸（檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等）、吡啶、金屬離子（Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+）[22]。吡啶衍生物是維生素、酶的重要組成部分，金屬離子可參與酶促反應，提高酶活，增加蛋白表達，蛋白質表達量與基因轉錄水平在全局層面上有較高的相關性[23-24]。添加糖蜜提高EMP途徑相關基

圖3 qRT-PCR分析糖蜜對EMP途徑相關基因轉錄的影響Fig.3 Analysis of the effect of molasses on transcription of genes encoding in EMP by qRT-PCR

3 結 語

本文考察了糖蜜預處理方法及糖蜜添加量對C.glutamicum SYPS-062 33a ΔSSA-PS 發(fā)酵產 L-絲氨酸過程的影響。以質量分數(shù)為9%蔗糖和1%糖蜜總糖為混合碳源有利于菌體生長及產L-絲氨酸。在以10%蔗糖作為碳源時，添加總糖為0.24%的硫酸法預處理糖蜜時，對重組菌株的生長及產L-絲氨酸最有利。同時，低質量分數(shù)糖蜜的添加提高了EMP途徑關鍵基因（pgi、pfkA、glpX、gap 及 pgk）的轉錄水平。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，發(fā)酵120 h，菌體生物量OD562、L-絲氨酸產量和糖酸轉化率分別為76.37、32.76 g/L和0.33 g/g蔗糖，較對照組分別提高了23.82%、29.44%和29.44%。