藜麥黃酮類化合物的提取及測定方法研究進展

付榮霞，周學(xué)永*，李航，崔艷，Rajasab A H

(1.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院， 天津 300384; 2.古爾巴加大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，印度 古爾巴加 585308)

原產(chǎn)于南美洲安第斯高原的藜麥為藜科藜屬的一年生植物[1]。藜麥具有豐富的營養(yǎng)價值，蛋白質(zhì)、淀粉及脂肪含量分別為12.5%～16.7%、58.1%～64.2%和5.5%～8.5%，且含有均衡比例的必需氨基酸[2]、多種維生素、礦物質(zhì)，除此之外，還含有生物活性的功能成分黃酮、皂苷、多酚等[3-5]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織指出藜麥是將來最具有開發(fā)價值的農(nóng)作物之一，是最適合人類食用、營養(yǎng)全面的食物[6]。藜麥的黃酮類含量較其他谷物類要高，例如，蘆丁、槲皮素、異槲皮素和山奈酚比蕎麥高，其余谷物類如大米、玉米等都不含黃酮類。在不久的將來可以將藜麥加工成具有保健功能的調(diào)味品，例如，藜麥醬油、藜麥醋、藜麥蠔油等。黃酮類化合物的藥理作用有多種，如降低血壓、降低血脂、抗氧化、抗病毒、抗癌、防癌等[7-9]，因此，在食品、藥品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，由于黃酮類化合物呈現(xiàn)黃色，是良好的天然色素，可用于食品加工業(yè)；提取的總黃酮也可用于制備調(diào)味品[10-12]。由此可見，對黃酮類化合物的提取及測定方法的探索意義重大。

1 藜麥黃酮類化合物提取方法

目前，常用溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法提取藜麥黃酮類化合物。

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法依據(jù)的原理是相似相溶，通過滲透、擴散等方式使溶劑進入細胞內(nèi)部，可溶性物質(zhì)溶解，導(dǎo)致細胞內(nèi)和細胞外濃度不同，為了保持溶液的平衡，水分子從濃度低的一方擴散到濃度高的一方。選用的提取溶劑要對黃酮化合物有較大的溶解度，且不與其發(fā)生反應(yīng)，此外，還要考慮溶劑的安全性、是否經(jīng)濟易得等。最常用于黃酮類化合物的提取溶劑為甲醇、乙醇、丙酮和水。溶劑提取法的優(yōu)點是易于操作、設(shè)備簡單、成本低等，但同時也有一些缺點，如產(chǎn)率不高、溶劑易殘留、安全性低等。華艷宏等[13]利用超聲波浸提方式，分別選用不同的溶劑(蒸餾水、甲醇、丙酮、乙醇等)研究藜麥種子提取物中總黃酮的含量，結(jié)果顯示：由于溶劑的不同提取得到的藜麥種子總黃酮在1.34～1.98 mg/g范圍內(nèi)變動，其中，得到總黃酮較高的溶劑為70%乙醇、蒸餾水，但兩者差異不顯著。孫雪婷等以藜麥種子為材料，采用乙醇回流法提取總黃酮，對影響提取率的因素進行研究。結(jié)果顯示：影響最大的為料液比，其次為提取時間，再次為乙醇體積百分數(shù)，影響最小的為提取溫度，得到的最優(yōu)提取條件是80%的乙醇，料液比1∶30， 60 ℃提取60 min，采用此工藝條件，得到2.64 mg/g黃酮。

1.2 微波輔助提取法

微波可以轉(zhuǎn)變電磁能為熱能，引起樣品溫度很快增高，在加熱過程中細胞膜和細胞壁被細胞內(nèi)液態(tài)水汽沖破，出現(xiàn)微小孔洞，溶劑容易進入細胞，有效成分被溶解和釋放出來。微波輔助提取法的特點是選擇性高、溶劑耗量少、節(jié)約能源、受熱均勻，可以較好地保留有效成分，產(chǎn)品提取率高。梁彬等[14]利用微波輔助提取法，以乙醇為溶劑提取藜麥種子總黃酮，對其影響因素——料液比、微波功率和時間進行探討。結(jié)果顯示：總黃酮的最優(yōu)提取工藝是料液比1∶50，微波功率260 W下提取125 s，平均提取量為6.5 mg/g。

1.3 超聲波輔助提取法

由超聲波引起的震動和空化作用可以保持被提取物的結(jié)構(gòu)和生物活性不變，細胞瞬間破裂，通過擴散作用使細胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來，進入溶劑中。超聲波提取易于操作，能夠節(jié)約提取時間，提高得率。董晶等以藜麥種子為材料，利用超聲波提取黃酮，確定的最優(yōu)條件是：選擇超聲波功率240 W，80%的乙醇，料液比1∶50，50 ℃浸提30 min。董施彬等[16]確定的去皮藜麥種子黃酮提取的最佳條件是：90%的乙醇，料液比1∶10，超聲波提取25 min后， 經(jīng)90 ℃回流提取2 h，得到總黃酮3.861 mg/g。

2 藜麥黃酮類化合物含量的測定方法

高效液相色譜法和分光光度法主要用于藜麥黃酮類化合物含量的測定，此外，超微弱發(fā)光法可用于黃酮含量的快速檢測。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜的流動相是液體，利用高壓泵輸送洗脫液，使待測樣品產(chǎn)生移動，以致各組分被分離，高靈敏度的檢測器將其轉(zhuǎn)化成可供檢測的信號，實現(xiàn)定性定量分析。特點是測定的樣品范圍廣、效率高、成本低、靈敏度高、測定結(jié)果準確等，但設(shè)備昂貴、流動相消耗較多、檢測時間較長。Hirose等測定了藜麥的黃酮含量(高效液相色譜法)，證實不同品種間存在較大差別，尤其是槲皮素和山奈酚的含量。熊成文等檢測了藜麥中槲皮素和山奈酚的含量，選擇甲醇溶液(80%)為提取溶劑，先用超聲波和熱回流提取樣品，之后用濃鹽酸水解，利用高效液相色譜法檢測水解液中兩種組分的含量。色譜條件：固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為CH3OH-0.4%H3PO4溶液(55∶45)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，360 nm波長下進行檢測，定量方法為外標法。結(jié)果顯示：槲皮素和山奈酚的檢測范圍分別是0.02～0.40 μg和0.01～0.20 μg時，線性關(guān)系良好，平均回收率分別是91.0%和89.3%，相對標準偏差分別是0.7%和4.5%(n=9)。馬麟等[16]利用超聲波輔助提取技術(shù)、反相高效液相色譜檢測方法研究了藜麥中碳苷黃酮類化合物，色譜柱選用Diamonsil-C18，流動相為酸性甲醇-水，梯度洗脫，固定流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，同時檢測樣品中的葒草素、異葒草素及牡荊素，結(jié)果顯示：精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.2 分光光度法

分光光度法具有標準品容易獲取、易于操作、測定結(jié)果可靠的特點，是黃酮類化合物最常用的定量方法之一。黃酮類化合物中的一些分子相對活躍，能與某些金屬鹽發(fā)生反應(yīng)，得到有色絡(luò)合物，可以通過光譜檢測到顏色的變化，因此，測定黃酮類化合物常使用硝酸鋁和氯化鋁等顯色劑。陸敏佳等[17]采用分光光度法測定藜麥葉片中黃酮類化合物的含量，發(fā)現(xiàn)分光光度法雖然易于操作、結(jié)果可靠，但是脂類物質(zhì)會對測定結(jié)果造成影響。重復(fù)性試驗及回收率試驗證明，分光光度法適合測定總黃酮含量，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。由此可見，藜麥葉片中的脂類物質(zhì)含量不影響黃酮類化合物的提取和測定。馮煥琴等選擇乙醇濃度、提取溫度和時間3個因素，通過響應(yīng)面試驗研究藜麥種子總黃酮得率，探討兩種顯色劑(氯化鋁、硝酸鋁)的使用對總黃酮測定的影響，結(jié)果表明：使用硝酸鋁作為顯色劑實驗誤差小，結(jié)果穩(wěn)定，可用于測定藜麥種子中總黃酮的含量。

2.3 超微弱發(fā)光法

黃酮含量的快速檢測可以利用超微弱發(fā)光法。超微弱發(fā)光是生物生命活動的表現(xiàn)形式之一，它能靈敏地反映機體的生理生化狀態(tài)。黃酮類化合物可以阻止自由基鏈反應(yīng)，理論上，種子中黃酮類化合物的含量與自由基的數(shù)量呈負相關(guān)，而后者又與發(fā)射的光子數(shù)量呈正相關(guān)，因此，黃酮類化合物的含量應(yīng)該與發(fā)射的光子數(shù)量呈負相關(guān)。董艷輝等[18]證實了藜麥種子中黃酮類化合物的含量越高，超微弱發(fā)光值就越低，二者之間呈極顯著負相關(guān)。常規(guī)育種時，檢測藜麥種子中的黃酮含量需要測定大量樣品，操作繁瑣，耗費時間較多，而采用超微弱發(fā)光法檢測，結(jié)果比較準確，且檢測過程迅速、簡單，對種子無損。因為超微弱發(fā)光法具有較高的靈敏度，要求較嚴格的環(huán)境，所以精確度不高，在實際操作時各種影響因素都要加以考慮，確保結(jié)果的可靠性。

3 結(jié)語

藜麥是營養(yǎng)全面的食品，富含多種生物活性成分，有很高的營養(yǎng)價值和極好的保健功能。目前，雖然我國大量種植藜麥，但對藜麥生物活性成分的提取和測定等方面的研究仍處于初步階段，對藜麥黃酮類化合物的提取方法多數(shù)應(yīng)用傳統(tǒng)分離技術(shù)，還需要進一步提高提取率，降低提取成本。鑒于藜麥的高潛在利用價值，對提取工藝和測定方法的要求也不斷提高，不僅要有高的提取率、好的產(chǎn)品質(zhì)量，而且測定方法還要求準確簡便、省時省力。因此，提高藜麥有效成分的提取率，減少有害成分和雜質(zhì)的殘留，減少環(huán)境污染以及發(fā)展聯(lián)用技術(shù)以進行實時監(jiān)測將具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。