顏思璐，高穎博，馮海嫦

(1.廣州市白云區(qū)婦幼保健院新生兒科；2.廣州市白云區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，廣東 廣州 510410)

胎膜早破是妊娠期常見的并發(fā)癥之一，主要是指臨產(chǎn)前胎膜破裂，研究發(fā)現(xiàn)感染是導(dǎo)致胎膜早破的主要原因之一[1]。胎膜破裂后，其屏障保護(hù)作用消失，但此時(shí)新生兒的免疫功能尚未發(fā)育完善，容易被各種病原體侵入體內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)感染，這是導(dǎo)致胎膜早破新生兒死亡的主要原因之一，可能引起早產(chǎn)及母嬰圍生期感染等嚴(yán)重的并發(fā)癥，危及母嬰安全，因此早期準(zhǔn)確診斷新生兒宮內(nèi)感染是我們醫(yī)生工作的一大重點(diǎn)[2]。本文旨在通過(guò)測(cè)定胎膜早破并有絨毛膜羊膜炎的孕母的外周血Toll樣受體和新生兒的Toll樣受體，探究其與新生兒宮內(nèi)感染的關(guān)聯(lián)性，從而通過(guò)母親的陽(yáng)性指標(biāo)用于指導(dǎo)新生兒宮內(nèi)感染的早期診斷及臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)以下納入排除標(biāo)準(zhǔn)選取我院2015年1月至2018年1月于產(chǎn)科住院足月胎膜早破的單胎初產(chǎn)婦120例，分娩后的新生兒均按高危兒轉(zhuǎn)新生兒科。產(chǎn)后胎盤胎膜常規(guī)送病理檢驗(yàn)，根據(jù)病理檢查結(jié)果有無(wú)絨毛膜羊膜炎將孕母分為感染組和非感染組，其中感染組有68例，非感染組有52例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18 周歲；(2)首次妊娠者；(3)單胎；(4)足月胎膜早破(妊娠37周以后發(fā)生的胎膜早破)并未使用抗生素者或使用抗生素前；(5)無(wú)嚴(yán)重的出凝血功能障礙者；(6)符合第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》中胎膜早破的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：①陰道宮頸消毒后，在窺器直視下按壓宮底見羊水流出者；②拭去宮頸口處黏液及血液，宮頸流出液測(cè)pH>7；③陰道后穹窿液涂片見羊齒植物葉狀結(jié)晶；④羊膜鏡檢查可以直視胎先露部，未見前羊膜囊。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并有胎兒生長(zhǎng)受限、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓疾病、心血管系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、肝病、風(fēng)濕性疾病活動(dòng)期等其他系統(tǒng)感染等合并癥及并發(fā)癥者、未足月胎膜早破者、雙胎及多胎胎膜早破者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 母血采集：自然分娩的孕婦在活躍期內(nèi)、剖宮產(chǎn)的孕婦在術(shù)前30 min，抽取肘靜脈血5 mL，并且立即注入EDTA抗凝管中，混勻后4 ℃保存，送金域檢驗(yàn)中心，采用Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)RT-PCR法檢測(cè)TLR-2和 TLR-4mRNA。

新生兒血采集：所有新生兒均于24 h內(nèi)采集血7 mL，5 mL送檢驗(yàn)科進(jìn)行血常規(guī)、PCT、CRP及血培養(yǎng)檢測(cè)，試劑盒為48孔配置，6孔用于陰陽(yáng)對(duì)照，空白和質(zhì)控。另外周血2 mL送金域檢驗(yàn)中心，方法同上述，檢測(cè)TLR-2 mRNA和 TLR-4 mRNA。

1.2.2 標(biāo)本處理 制備血清：所有血液標(biāo)本乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，F(xiàn)icoll (P：1.077)密度梯度離心法分離PBMC備用(室溫下，3 000 r/min離心20 min)。參照TRIZOL[GLBCOBRL公司]的一步法提取總RNA，然后應(yīng)用RT-PCR儀器進(jìn)行CDNA逆轉(zhuǎn)錄。

TLR2-mRNA和TLR4-mRNA檢測(cè)方法；由上海生物工程有限公司合成引物設(shè)計(jì)，采用SYBER green I 和ABI 7000PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR，采用熒光定量法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

血常規(guī)、PCT、CRP檢測(cè)：采血當(dāng)日進(jìn)行檢測(cè)，CRP檢測(cè)采用免疫比濁法，PCT檢測(cè)采用雙抗體夾心法。

血培養(yǎng)：胎兒一經(jīng)娩出，在使用抗生素前即采靜脈血2 mL，注入細(xì)菌培養(yǎng)基。

胎盤胎膜常規(guī)送病理檢驗(yàn)：胎盤娩出后，分別取大小約2 cm×2 cm 胎盤和胎膜組織，取后立即置于10%甲醛溶液中固定，立即送病理檢查。經(jīng)過(guò)專人采用HE染色的雙盲法閱片，絨毛膜羊膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)為電鏡下每高倍視野胎膜或胎盤任何一處的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)大于11個(gè)[4]。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 孕母均于臨產(chǎn)前行外周血檢測(cè) TLR-2 和TLR-4mRNA 定量檢測(cè)，生產(chǎn)后胎盤胎膜常規(guī)送病理檢查根據(jù)結(jié)果是否診斷絨毛膜羊膜炎回顧將孕母及其新生兒分為感染組和非感染組。所生的新生兒均按高危兒轉(zhuǎn)新生兒科，并分別于第 1、7 天行外周血 TLR-2 mRNA 和 TLR-4mRNA 定量檢測(cè)，PCT、CRP濃度檢測(cè)，血培養(yǎng)，并臨床觀察呼吸道、消化道、泌尿道等有無(wú)感染的臨床表現(xiàn)。新生兒感染主要包括了敗血癥、肺炎、壞死性小腸結(jié)腸炎等，感染具體的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第四版《實(shí)用新生兒學(xué)》[5]。記錄并收集數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析母親與患兒之間Toll樣受體水平及新生兒出生后感染的臨床表現(xiàn)有無(wú)相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用方差分析，分類變量采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)分析方法進(jìn)行相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的一般情況比較 感染組和非感染組的產(chǎn)婦均來(lái)自本院住院分娩且年齡、孕周相近的初產(chǎn)婦，兩組孕婦年齡及孕周均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組入選孕母具有可比性，見表1。

2.2 感染組與非感染組新生兒之間比較情況 感染組與非感染組新生兒之間相比較，感染組的新生兒的白細(xì)胞水平、CRP 、PCT水平均較非感染組明顯升高(P<0.05)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。感染組新生兒血培養(yǎng)陽(yáng)性率及新生兒存在感染表現(xiàn)的陽(yáng)性率均明顯比非感染組新生兒升高(P<0.05)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示胎盤胎膜病理結(jié)果診斷絨毛膜羊膜炎的新生兒絕大多數(shù)臨床上同時(shí)提示感染，見表2。

表1 兩組孕婦年齡和孕周相比較情況

表2 感染組與非感染組新生兒之間相比較情況

2.3 感染組與非感染組新生兒之間 Toll 樣受體水平比較情況

感染組與非感染組新生兒之間 Toll 樣受體水平相比較，感染組新生兒的TLR-2mRNA及TLR-4mRNA水平在第1天及第7天時(shí)均較非感染組明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示新生兒 Toll 樣受體水平升高與新生兒宮內(nèi)感染密切相關(guān)，見表3。

表3 感染組與非感染組新生兒之間Toll樣受體水平相比較情況

2.4 感染組與非感染組孕母之間 Toll 樣受體水平比較情況 感染組與非感染組孕母之間 Toll 樣受體水平比較，感染組孕母的Toll 樣受體水平較非感染組明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示孕母的Toll 樣受體水平升高與新生兒宮內(nèi)感染密切相關(guān)，見表4。

表4 感染組與非感染組孕母之間Toll樣受體水平比較情況

3 討 論

孕母的胎膜是把胎兒與外界環(huán)境相隔離開的天然保護(hù)屏障，給胎兒的生長(zhǎng)和發(fā)育提供一個(gè)密閉又安全的環(huán)境條件，能夠有效地阻止病原體等外界有害物質(zhì)入侵胎兒體內(nèi)對(duì)胎兒造成損害。正因如此，孕母胎膜的完整性在妊娠過(guò)程中對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育具有至關(guān)重要的影響[6]。胎膜早破的孕母在分娩前胎膜就發(fā)生破裂，失去完整性，從而導(dǎo)致胎兒失去了胎膜屏障的保護(hù)作用，孕母腹腔及陰道內(nèi)的各種病毒及細(xì)菌能透過(guò)胎膜入侵胎盤，進(jìn)一步造成了新生兒宮內(nèi)感染，引起絨毛膜羊膜炎及新生兒宮內(nèi)感染。

新生兒宮內(nèi)感染在新生兒感染中占較大比例，也是早期新生兒死亡的主要原因之一。因此早期準(zhǔn)確診斷新生兒宮內(nèi)感染并及時(shí)使用抗生素是臨床醫(yī)生工作的一大重點(diǎn)和難點(diǎn)。胎膜早破合并宮內(nèi)感染早期，多數(shù)無(wú)臨床癥狀，如發(fā)展到臨床絨毛膜羊膜炎出現(xiàn)典型的癥狀及體征后再予治療，將大大增加母兒發(fā)病率和病死率。盡管有多個(gè)衡量感染的指標(biāo)，但均存在特異性不高或所需時(shí)間較長(zhǎng)等局限性，血培養(yǎng)作為細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，有培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、易被污染等缺點(diǎn)，使得診斷不及時(shí)或漏診影響檢驗(yàn)結(jié)果。

C反應(yīng)蛋白和降鈣素原是目前廣泛應(yīng)用于臨床的感染性生物標(biāo)志物，但在部分非感染性疾病中也可呈高表達(dá)，不能準(zhǔn)確反應(yīng)機(jī)體的感染狀態(tài)，特異性較低，且PCT受體內(nèi)毒素以外多種介質(zhì)影響，缺乏早期準(zhǔn)確診斷的意義，給臨床早期判斷帶來(lái)很大困難。羊膜腔內(nèi)感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是羊膜腔穿刺抽取羊水進(jìn)行微生物培養(yǎng)，但是羊水穿刺為有創(chuàng)性操作，消毒不嚴(yán)可引起羊膜腔內(nèi)感染；且細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基的選擇和抗生素的抑菌作用導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率較低，這些原因使羊膜腔穿刺的臨床意義不大。目前臨床上對(duì)宮內(nèi)感染的診斷主要依靠孕婦體溫升高、羊水污染、母體心率和(或)胎心率加快等，但這些指標(biāo)出現(xiàn)較晚，且特異性和敏感性均較差[7]。

Toll樣受體是1997年Medzhitov[8]等第1次克隆人類Toll樣受體，Toll樣受體可以有效識(shí)別出各種病原菌，進(jìn)而引發(fā)一系列的信號(hào)介導(dǎo)體內(nèi)釋放出炎癥介質(zhì)，啟動(dòng)機(jī)體的自然免疫反應(yīng)并且激活獲得性免疫系統(tǒng)，從而在抗感染的免疫機(jī)制中發(fā)揮出重要的作用。Toll 樣受體是一類進(jìn)化保守的胚系編碼的模式識(shí)別受體，同時(shí)也是天然免疫系統(tǒng)中特異的病原式識(shí)別受體和I型跨膜受體，能夠通過(guò)模式識(shí)別的方式來(lái)識(shí)別進(jìn)而結(jié)合不同的病原菌的分子結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)體內(nèi)的天然免疫系統(tǒng)[9]。Toll樣受體在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和急性炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，不同的Toll樣受體識(shí)別的病源譜不同[10]，目前研究較多的是TLR-2和TLR-4，TRL-4主要可以識(shí)別真菌、熱休克蛋白，特別是革蘭氏陰性菌，而TLR-2主要識(shí)別分歧桿菌、疏密螺旋體和支原體，特別是能識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌。

Kim等人的研究發(fā)現(xiàn)[11]，TLR4、TLR2在合并有絨毛膜羊膜炎的孕母中表達(dá)水平明顯高于正常的孕母。曹耀輝在胎膜早破的孕母的胎盤組織中TLR2和TLR4的表達(dá)及與絨毛膜羊膜炎的關(guān)系的研究[12]中提示，TLR4和TLR2表達(dá)水平上升高，與胎膜是否完整無(wú)關(guān)，而是與孕母絨毛膜羊膜炎密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，感染組與非感染組新生兒相比較，感染組新生兒的白細(xì)胞水平、CRP 、PCT水平、血培養(yǎng)陽(yáng)性率及新生兒存在感染表現(xiàn)的陽(yáng)性率均明顯比非感染組新生兒升高(P<0.05)；感染組新生兒的TLR-2mRNA及TLR-4mRNA水平在第1天及第7天時(shí)均較非感染組明顯升高(P<0.05)；感染組孕母的Toll 樣受體水平較非感染組明顯升高(P<0.05)；提示孕母的外周血 Toll 樣受體和新生兒的 Toll 樣受體水平與新生兒宮內(nèi)感染密切相關(guān)，母親的陽(yáng)性指標(biāo)可用于指導(dǎo)新生兒宮內(nèi)感染的早期診斷及臨床治療。

綜上所述，有胎膜早破并有絨毛膜羊膜炎的孕母的外周血Toll樣受體和新生兒的Toll樣受體水平與新生兒宮內(nèi)感染密切相關(guān)，可根據(jù)患兒母親胎膜早破病史結(jié)合其TLR-2和 TLR-4 mRNA水平判斷新生兒有無(wú)存在宮內(nèi)感染，進(jìn)而指導(dǎo)臨床處理，改善母兒結(jié)局。