周芃來，馬葉婷，李潤麗，李 瑾，高文偉，劉 卿

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801）

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）幾乎能感染所有溫血動物，引起危害嚴重的，呈世界性流行的人獸共患弓形蟲病[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球約有33%的人口感染弓形蟲，我國人群弓形蟲感染率約為7.88%[2-3]。免疫功能正常的人感染弓形蟲后，一般無明顯臨床癥狀，但是免疫功能低下或缺陷者（如孕婦及HIV患者等）感染后，會遭受致命的傷害甚至死亡[4-5]。孕畜感染弓形蟲后，會發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或畸胎等，給畜牧業(yè)帶來較大經(jīng)濟損失[6]。同時，弓形蟲病作為一種食源性人獸共患原蟲病，可通過污染的動物源性食品，隨人類消費而傳播。

弓形蟲感染宿主細胞離不開三大分泌細胞器，分別為微線體、棒狀體和致密顆粒[7]。致密顆粒細胞器分泌的致密顆粒蛋白（Dense granule antigens，GRAs）目前已鑒定出約30種。其中，有些致密顆粒蛋白已被證實是較好的弓形蟲診斷抗原，更重要的是其中一些多態(tài)性蛋白可用于弓形蟲的血清學分型，例如GRA3、GRA6和GRA7蛋白[8-10]。弓形蟲GRA15蛋白也是多態(tài)性蛋白，但是目前沒有關于這方面的研究報道[11]。本研究通過表達純化弓形蟲GT1蟲株GRA15（GRA15GT1）蛋白，并對其免疫反應原性進行分析，以期為基于GRA15蛋白的弓形蟲診斷及血清學分型試劑的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株cDNA、菌種及質(zhì)粒

弓形蟲GT1蟲株的cDNA：由本實驗室保存；原核表達載體pGEX-6p-1：購自山西賽奧生物科技有限公司；DH5ɑ及BL21大腸桿菌感受態(tài)細胞：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及DAB顯色試劑盒：購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR Max Premix（2×）及rTaq酶：購自大連Takara公司；Protein GST Resin：購自全式金生物科技有限公司；抗GST標簽鼠單克隆抗體：購自康為世紀生物科技有限公司；IHA間接血凝試劑盒中的豬弓形蟲陽性血清：購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所；羊抗鼠HRP標記二抗：購自北京奧博森生物技術(shù)有限公司；HRP標記的羊抗豬二抗：購自美國Proteintech Group公司；PAGEMASTER Protein Standard蛋白Marker：購自南京金斯瑞生物科技有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder：購自美國Thermo Scientif i c公司。

1.3 引物設計

依據(jù)ToxoDB數(shù)據(jù)庫（http://toxodb.org/toxo/）和NCBI數(shù)據(jù)庫基因信息，采用Primer 6.0軟件設計特異性引物擴增弓形蟲GT1蟲株的GRA15基因，上游引物P1序列為5'-GGGGGATCCATAATTCGGTGGCTTGGGTATCTTAC-3'，下游引物P2序列為5'-GGGGAATTCTCATGGAGTTACCGCTGATTGTGTG-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 GRA15GT1基因擴增

以弓形蟲GT1蟲株的cDNA為模板，用Prime STAR Max DNA Polymerase進行PCR擴增，25 μL反應體系為：Prime STAR Max Premix（2×）12.5 μL，引物P1/P2各0.25 μL，模板 1 μL，滅菌水 11 μL。PCR反應條件為：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收切下目的片段。

1.5 pGEX-6p-1-GRA15GT1載體構(gòu)建

對回收的GRA15GT1基因加A尾，25 μL的反應體系和條件如下：GRA15GT1基因回收產(chǎn)物19.5 μL，rTaq酶0.5 μL，LA Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2.5 μL，72 ℃ 30 min，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶。將加A尾的GRA15GT1基因連接至T Vector pMD19（Simple）載體中，轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，并送上海生工生物工程有限公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19T-GRA15GT1。

對pMD19T-GRA15GT1載體用BamHI和EcoRI進行雙酶切，回收目的條帶。將目的基因連接至經(jīng)同樣酶切處理的pGEX-6p-1載體，并轉(zhuǎn)化入DH5ɑ感受態(tài)細胞。菌液PCR鑒定為陽性的提取質(zhì)粒，并進行雙酶切和測序鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pGEX-6p-1-GRA15GT1。

1.6 GRA15GT1融合蛋白表達及純化

將pGEX-6p-1-GRA15GT1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，將菌液PCR鑒定正確的菌液按1:50的比例接種到8 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min，培養(yǎng)至菌液OD600達到0.6時，吸出2 mL菌液作為對照，剩余菌液加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃ 220 r/min，誘導6 h；分別將2 mL對照組菌液和誘導表達的菌液進行超聲破碎，離心收集破碎后的上清和沉淀，分別加入蛋白上樣緩沖液后100 ℃煮沸5 min。然后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后觀察蛋白是否表達及分析可溶性。

小量誘導驗證GRA15GT1融合蛋白為可溶性表達后，收集500 mL誘導菌液，8 000 r/min離心3 min，收集菌體，用PBS清洗3次，加入適量PBS重懸后進行超聲破碎，然后離心收集破碎后的上清；采用全式金的Protein GST Resin試劑盒純化GRA15GT1融合蛋白。

1.7 Western blot分析

將純化后的GRA15GT1融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（共兩張膜，每張膜均轉(zhuǎn)有GRA15GT1融合蛋白），用2.5%的脫脂奶粉封閉液37 ℃封閉2 h。用PBST洗膜后，第1張膜加入1: 3 000稀釋的抗GST標簽蛋白的鼠單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，用PBST洗膜后再加入1: 6 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h；第2張膜加入1: 300稀釋的豬抗弓形蟲陽性血清，用PBST洗膜后再加入1: 5 000稀釋的HRP標記的羊抗豬二抗，37 ℃孵育1 h。用PBST洗膜后加入DAB顯色液，避光顯色5～10 min后用蒸餾水終止反應，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GRA15GT1基因擴增

以弓形蟲GT1蟲株的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得與預期一致的1 755 bp的片段（圖1）。

圖1 GRA15GT1基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 pGEX-6p-1-GRA15GT1酶切及測序鑒定

用BamHⅠ 和EcoRⅠ 對pGEX-6p-1-GRA15GT1質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。由圖2可見：一條大小為4 984 bp，與pGEX-6p-1的線性片段大小一致；另一條大小為1 755 bp，與弓形蟲GRA15GT1基因大小相符。測序結(jié)果與理論序列的比對結(jié)果一致。

圖2 pGEX-6p-1-GRA15GT1質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 GRA15GT1融合蛋白表達及純化

誘導前和誘導后的表達菌經(jīng)超聲破碎后離心，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，誘導表達菌破碎離心后的上清與對照組相比，在80～120 kDa處有特異性條帶。誘導表達菌破碎離心的上清經(jīng)純化后，進行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)在100 kDa處有單一條帶，比理論值87 kDa稍大（圖3-a）。純化蛋白利用小鼠抗GST標簽抗體作為一抗進行免疫印跡反應，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶，且大小與SDS-PAGE電泳結(jié)果一致（圖3-b）。

圖3 純化的GRA15GT1融合蛋白表達分析

2.4 GRA15GT1融合蛋白反應原性的Western blot分析

對純化蛋白利用豬弓形蟲陽性血清作為一抗進行免疫印跡反應，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶，且大小與SDS-PAGE電泳結(jié)果及利用小鼠抗GST 標簽抗體作為一抗進行的免疫印跡反應結(jié)果一致（圖4）。

圖4 Western blot分析GRA15GT1融合蛋白反應原性

3 討論

弓形蟲病是危害嚴重的人獸共患原蟲病，做好弓形蟲病診斷及掌握其流行病學資料對于該病防控具有重要意義。弓形蟲病診斷方法主要有臨床診斷、病原學診斷、PCR診斷及血清學診斷等[12-13]。弓形蟲病的臨床癥狀與某些傳染病相似，單靠臨床癥狀難以診斷[5，14]。病原學診斷依賴于顯微鏡檢查，然而，僅基于光鏡的蟲體辨別是不敏感、不可靠的。電鏡也用于檢測小鼠腦組織囊腫和感染貓小腸卵囊，但難以常規(guī)使用[15-16]。PCR技術(shù)因具有特異、敏感、快速等優(yōu)點，已普遍應用于弓形蟲病診斷和流行病學調(diào)查[17]，更重要的是PCR可用于弓形蟲不同蟲株的分型[12]，但PCR技術(shù)在進行非卵囊樣品的流行病學調(diào)查時存在缺陷，如需要活體動物組織等。

血清學診斷是進行弓形蟲流行病學調(diào)查的重要手段，適合大規(guī)模樣品檢測，方法包括改良凝集試驗（MAT）、間接血凝實驗（IHA）及ELISA等[2，18-20]。其中，ELISA方法可用抗原（速殖子裂解抗原或重組表達抗原）或抗體對弓形蟲感染情況進行檢測，例如SAG1、MIC1、MIC3及GRA3等重組表達抗原[21-23]。致密顆粒蛋白在弓形蟲入侵過程中不發(fā)揮作用，其在蟲體侵入宿主細胞形成納蟲泡后才開始分泌。弓形蟲入侵宿主細胞時分泌的蛋白雖然可引起機體免疫反應產(chǎn)生抗體，但最終可能被滅殺而未在宿主細胞內(nèi)增殖。鑒于此，使用致密顆粒蛋白而不是入侵相關蛋白（如微線蛋白）作為診斷抗原，可能檢測結(jié)果更準確。但是目前未有關于弓形蟲GRA15GT1蛋白免疫反應原性的報道。本研究表明，GRA15GT1蛋白能夠成功地與豬弓形蟲陽性血清反應，從而豐富了診斷弓形蟲感染的可用抗原。

基于弓形蟲多態(tài)性蛋白的ELISA方法可用于弓形蟲的血清學分型，例如GRA3，GRA6和GRA7蛋白等[12]。但是目前沒有關于弓形蟲多態(tài)性GRA15蛋白血清學分型方面的研究。GT1蟲株GRA15蛋白與PRU蟲株及RH蟲株的GRA15蛋白相比，均存在共有肽段，因此本研究表達和分析了GRA15GT1蛋白的免疫反應原性[11]。該研究是評價GRA15GT1蛋白在GT1蟲株、PRU蟲株及RH蟲株血清學分型中應用的前提。

4 結(jié)論

本研究成功表達了弓形蟲GT1蟲株GRA15蛋白，經(jīng)Western blot分析顯示，該蛋白能夠與豬弓形蟲陽性血清反應，表明表達的GRA15GT1蛋白具有較好的反應原性。這為下一步分段表達GRA15GT1蛋白，研究其在弓形蟲血清學分型中的應用奠定了基礎。