許 晨，周 勇，史玉恒，范玉頂，劉文枝，江 南，趙建青，曾令兵

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

鯉皰疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)[1]，又稱為金魚(Carassiusauratusauratus)造血器官壞死癥病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)[2]或皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒(herpesviral haematopoietic necrosis virus，HVHNV)[3]，與鯉痘瘡病毒(Cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1)、錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV，CyHV-3)同屬異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)成員[4，5]。鯉皰疹病毒II型可感染各種規(guī)格的養(yǎng)殖鯽魚，死亡率高達(dá)90%～100%[1，6]，給我國鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。目前，圍繞CyHV-2及其引起的鯽造血器官壞死癥已開展流行病學(xué)、病原檢測[8，9]、組織病理[10，11]、理化及生物學(xué)特性[12]、超微結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生[13]、診斷技術(shù)與疫苗[14，15]等研究，但是關(guān)于CyHV-2與宿主細(xì)胞相互作用分子機(jī)制的研究較少。開展CyHV-2與宿主細(xì)胞受體相互作用的研究對于闡明CyHV-2的感染機(jī)制有重要意義。

目前，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的方法主要有酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)、pull down技術(shù)、串聯(lián)親和層析技術(shù)等[16]。酵母雙雜交技術(shù)作為一種高效研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法，不僅可以檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，而且可以篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白，被廣泛用于研究病原與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制[17，18]。已有研究表明，CyHV-2 ORF25編碼蛋白與GiCB細(xì)胞孵育后能夠吸附于GiCB細(xì)胞表面[19]，因此探尋CyHV-2 ORF25的相互作用蛋白，將有助于深入了解病毒與宿主間的相互作用機(jī)制。本研究以鯽腦組織細(xì)胞GiCB細(xì)胞的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增獲得雙鏈cDNA，與載體pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，構(gòu)建GiCB細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫，再與表達(dá)CyHV-2 ORF25編碼蛋白的誘餌菌雜交，初步篩選得到與CyHV-2 ORF25編碼蛋白相互作用蛋白的陽性菌落。GiCB細(xì)胞酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建為研究CyHV-2與宿主細(xì)胞間的互作機(jī)制提供了重要研究工具，也為進(jìn)一步研究CyHV-2病毒的感染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鯽腦組織細(xì)胞系(Gibel carp brain，GiCB)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所建立并保存[20]，培養(yǎng)基為含10% 新生牛血清的M199，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

菌株與載體酵母Y2HGold和Y187菌株，酵母雙雜交載體pGADT7-Rec、pGBKT7、pGBKT7-lam、pGBKT7-53、pGADT7-T購于Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 GiCB細(xì)胞總RNA的提取

待傳代培養(yǎng)的GiCB細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)(25 cm2，Corning，USA)，去除培養(yǎng)液，胰酶消化后離心收集細(xì)胞置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肨rizol法提取GiCB細(xì)胞的總RNA。通過紫外分光光度計(jì)(260 nm和280 nm)檢測GiCB細(xì)胞的總RNA的吸光值、計(jì)算其濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳對GiCB細(xì)胞的總RNA的完整性進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建

1.2.2.1 cDNA合成及純化

參照Clontech公司Make Your Own “Mate & Plate” Library System試劑盒操作步驟，以提取的GiCB細(xì)胞總RNA為模板，合成cDNA。利用CHROMA SPINTM-400 Columns試劑盒(Clontech公司)將雙鏈cDNA進(jìn)行分離與回收，除去小片段的cDNA分子，并用溶解于50 μL的ddH2O。

1.2.2.2 文庫轉(zhuǎn)化子的收獲

利用限制性內(nèi)切酶SmaI將pGADT7-Rec載體線性化，并根據(jù)Clontech公司Yeast maker Yeast Transformation System 2步驟，將GiCB細(xì)胞cDNA和pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。取150 μL菌液涂布SD/-Leu缺陷性固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，約3～5 d至酵母菌落出現(xiàn)，收集SD/-Leu培養(yǎng)基上酵母菌，即為GiCB細(xì)胞cDNA酵母文庫。

1.2.3 cDNA 文庫的鑒定

1.2.3.1 轉(zhuǎn)化效率

雙鏈cDNA與載體pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187后，取轉(zhuǎn)化后的少量菌液分別稀釋一百倍和一千倍，取其中100 μL分別涂布SD/-Leu缺陷性固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d，對長出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率和文庫滴度，計(jì)算公式如下：

轉(zhuǎn)化效率=培養(yǎng)基上的單克隆數(shù)(CFU)×總轉(zhuǎn)化混合物體積(μL)×稀釋系數(shù)/稀釋混合物涂板體積(μL)×轉(zhuǎn)化質(zhì)粒質(zhì)量(μg)

文庫滴度=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂布菌液體積

1.2.3.2 插入片段

提取GiCB酵母雙雜交cDNA文庫的文庫質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，隨機(jī)選取若干克隆用引物T7/3′ AD(表1)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，并利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，同時(shí)送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序鑒定。

1.2.4 誘餌菌株pGBKT7-CyHV-2-ORF25(Y2HGold)自激活檢測

將誘餌菌株pGBKT7-CyHV-2-ORF25(Y2HGold)(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)、陰性對照菌株pGBKT7-lam(Y2HGold)(Clontech公司)和陽性對照菌株pGBKT7-53(Y2HGold)×pGADT7-T(Y187)(Clontech公司)分別劃線于SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/Aba+/X-α-Gal、SD/-Leu三種選擇性固體培養(yǎng)基上，觀察其生長情況。

1.2.5 酵母雙雜交文庫的篩選

利用pGBKT7-CyHV-2-ORF25(Y2HGold)誘餌菌株與GiCB酵母雙雜交cDNA文庫進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，篩選與CyHV-2 ORF25編碼蛋白互作的細(xì)胞受體。將1 mL活化的GiCB酵母cDNA文庫菌和4～5 mL誘餌菌株pGBKT7-CyHV-2-ORF25(Y2HGold)加入含有45 mL 2×YPDA 培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)的 2 L無菌三角錐瓶中，于30 ℃，30～50 r/min慢速震蕩培養(yǎng)20-24 h。離心收集菌體，并用10 mL 0.5×YPDA(含 50 μg/mL Kan)培養(yǎng)基重懸，取100 μL菌液涂布于雙缺SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA的選擇性固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3-5 d后，將選擇性培養(yǎng)基上的藍(lán)色克隆菌落轉(zhuǎn)移至四缺SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA選擇性固體培養(yǎng)基上反復(fù)篩選，以確定陽性克隆，并使用引物T7/3′AD(表1)，T7/3′BD(表1)進(jìn)行PCR檢測。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 GiCB 細(xì)胞總RNA提取

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測由Trizol試劑提取GiCB細(xì)胞總RNA，電泳結(jié)果可見清晰觀察到28 S和18 S兩條RNA條帶(圖1)，其亮度比約2∶1，而5 S RNA條帶亮度較弱，在分光光度計(jì)上測試A260 nm/A280 nm的值為1.89，表明提取GiCB細(xì)胞總RNA的純度和完整性較好，已達(dá)到合成GiCB細(xì)胞cDNA的要求。

圖1 GiCB細(xì)胞總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis analysis of total RNA from CiCB cells

2.2 cDNA文庫的構(gòu)建及保存

以GiCB細(xì)胞總RNA為模板，合成雙鏈cDNA，覆蓋率從100～3 000 bp，純化回收并去掉小于250 bp的條帶。將雙鏈cDNA與載體pGADT7-Rec混合共轉(zhuǎn)化至酵母Y187菌株中進(jìn)行同源重組，獲得GiCB細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫，提取文庫質(zhì)粒并用甘油對酵母cDNA 文庫進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 文庫質(zhì)量鑒定

將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后，隨機(jī)選取單克隆菌落以T7/3′ AD為引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果表明插入片段大部分在1 000 bp以上，平均長度約為1.5 kb(圖2)。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比較，結(jié)果顯示，插入片段與鯽魚和鯉魚的基因相似性較高(表2)。

圖2 文庫隨機(jī)菌落PCR電泳檢測Fig.2 Electrophoresis of PCR products of random colonies from the libraryM：DL 2000 DNA Marker；1-16：隨機(jī)挑取的單克隆

表2 鯽腦組織細(xì)胞文庫基因的測序分析Tab.2 Analysis of library gene of GiCB cells

雙鏈cDNA與載體pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187后，取10 μL菌液分別稀釋一百倍和一千倍，然后各取150 μL分別涂布SD/-Leu，對長出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋一百倍的SD/-Leu培養(yǎng)基上長出白色菌落1 280個(gè)，稀釋一千倍的SD/-Leu培養(yǎng)基上長出白色菌落120個(gè)，根據(jù)公式計(jì)算得出GiCB細(xì)胞cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母菌Y187的效率為1.03×106CFU/μg，GiCB細(xì)胞cDNA酵母表達(dá)文庫滴度約為1.24×106CFU/mL。

2.4 誘餌菌株自激活檢測

pGBKT7-CyHV-2-ORF25(Y2HGold)菌株在選擇性培養(yǎng)基中的生長結(jié)果表明：陰性對照菌株pGBKT7-lam(Y2HGold)和重組菌株pGBKT7-CyHV-2-ORF25(Y2HGold)在SD/-Trp/X-α-Gal選擇性固體培養(yǎng)基上長出白色菌落(圖3A)，在其他培養(yǎng)基上無菌落出現(xiàn)(圖3B，C)。陽性對照pGBKT7-53(Y2HGold)×pGADT7-T(Y187)在 SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/Aba+/X-α-Gal、SD/-Leu均長出菌落(圖3A，B，C)，且在SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/Aba+/X-α-Gal選擇性固體培養(yǎng)基上菌落呈藍(lán)色(圖3A，B)。說明重組菌株無自激活現(xiàn)象，可以進(jìn)一步進(jìn)行文庫篩選。

圖3 誘餌表達(dá)載體自激活檢測Fig.3 Detection of bait expression vector self-activation

2.5 誘餌蛋白ORF25的候選互作蛋白的篩選

pGBKT7-CyHV-2-ORF25(Y2HGold)誘餌菌株與cDNA文庫進(jìn)行雜交，分別使用雙缺SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA的選擇性固體培養(yǎng)基(圖4A)和四缺SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA選擇性固體培養(yǎng)基(圖4B)反復(fù)篩選，最后獲得陽性克隆。分別使用誘餌載體和文庫載體的通用引物對陽性克隆進(jìn)行PCR檢測并進(jìn)行測序分析。對測序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)誘餌載體通用引物擴(kuò)增的片段為ORF25(圖5)，文庫載體通用引物擴(kuò)增的片段中僅有1個(gè)cDNA序列的開放閱讀框正確。將該cNDA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)這一序列編碼蛋白與蛋白激酶C受體1(Receptor of activated protein kinase C1，RACK1)呈高度同源，同源性高達(dá)96%。

圖4 雜交后的陽性菌株Fig.4 The positive strains after hybridizationA：SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA雙缺固體選擇性培養(yǎng)基，B：SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA四缺固體選擇性培養(yǎng)基

圖5 陽性克隆的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 The detection of the positive strain with PCR assayM：DL5000；1：引物T7/3′AD檢測；2：引物T7/3′BD檢測

3 討論

cDNA文庫的質(zhì)量與總RNA的純度和完整性關(guān)系密切[21]，真核生物的28 S、18 S rRNA的質(zhì)量決定了總RNA的完整性。完整性較好的總RNA，其28 S與18 S rRNA的強(qiáng)度比一般為1.5～2.5∶1。本研究提取鯽魚腦細(xì)胞系GiCB的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示28 S與18 S rRNA的比約為2∶1，并且條帶清晰，提取的RNA質(zhì)量較好，可以用于cDNA文庫的構(gòu)建。

評(píng)價(jià)酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量好壞的關(guān)鍵因素是插入片段的大小和滴度[22]。根據(jù)計(jì)算，本研究構(gòu)建的GiCB酵母雙雜交cDNA文庫插入片段的平均長度約為1.5 kb，滴度約為1.24×106CFU/mL，均符合Clontech公司 SMART 文庫構(gòu)建的要求(原始文庫的庫容大于 1×106CFU)。該酵母雙雜交文庫具有較好的 cDNA 片段多態(tài)性和完整性，可用于進(jìn)一步的文庫篩選。

CyHV-2的ORF25基因?qū)儆贠RF25多基因家族，編碼病毒的膜蛋白，含有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，具有較好的免疫原性。已有研究表明酵母表達(dá)的ORF25編碼蛋白與GiCB細(xì)胞孵育后，感染CyHV-2，病毒滴度顯著降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ORF25編碼蛋白可特異性地吸附于GiCB細(xì)胞表面[19]。以CyHV-2 ORF25編碼蛋白為誘餌蛋白與cDNA文庫進(jìn)行雜交，篩選獲得陽性克隆，進(jìn)一步證實(shí)了該文庫的質(zhì)量和有效性。

將CyHV-2 ORF25編碼蛋白的陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序獲得陽性克隆的cDNA序列，將序列在NCBI中Blast比對，發(fā)現(xiàn)這一序列編碼蛋白與蛋白激酶C受體1(Receptor of activated protein kinase C1，RACK1)有96%的同源性。RACK1屬于WD40蛋白(色氨酸和天冬氨酸)家族成員，含有7個(gè)WD重復(fù)序列，分子量為36 kD。1991年，RACK1首次被鑒定為蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)受體的結(jié)合蛋白，RACK1 作為一種穿梭蛋白，可以改變 PKC 定位并發(fā)揮其生物學(xué)功能[23]。該蛋白參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子的募集、組裝和調(diào)控，在細(xì)胞的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能[24，25]。有研究表明，RACK1能夠作為接頭分子將HIV-1的Nef蛋白與細(xì)胞的PKC聚在一起，增強(qiáng)PKC對Nef蛋白的磷酸化[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)腮腺炎病毒V蛋白通過與RACK1結(jié)合，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和激活因子1(STAT1)從 STAT1、RACK1和IFN受體的復(fù)合物上脫落下來，從而抑制干擾素的抗病毒作用。根據(jù)CyHV-2 ORF25編碼蛋白與陽性克隆序列間的相互作用推測，CyHV-2 ORF25編碼蛋白可能通過與鯽魚的RACK1結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，以完成病毒的復(fù)制。但是關(guān)于陽性克隆序列與CyHV-2 ORF25編碼蛋白是如何發(fā)生作用仍然需要進(jìn)一步的驗(yàn)證及研究。在病毒粒子的組裝、釋放過程中，病毒和宿主間發(fā)生了怎樣的相互作用，其具體機(jī)制究竟是怎樣的都不清楚，尚需要進(jìn)一步的研究。對 CyHV-2 ORF25編碼蛋白的互作蛋白和作用機(jī)制進(jìn)行研究，將有助于揭示 CyHV-2的感染機(jī)理。

本研究成功構(gòu)建了GiCB酵母雙雜交cDNA文庫，并利用此文庫篩選到CyHV-2 ORF25編碼蛋白的互作蛋白的陽性菌落，推測CyHV-2 ORF25的互作蛋白可能是細(xì)胞受體-蛋白激酶C受體1。GiCB酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建為研究CyHV-2與宿主細(xì)胞間的互作機(jī)制提供了良好的技術(shù)平臺(tái)，也為進(jìn)一步研究CyHV-2的感染與致病機(jī)理奠定了前期基礎(chǔ)。