王思蘆，王紅明，趙艮勇，肖文淵，黃志秋

(西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，四川西昌615013))

隨著水產(chǎn)動(dòng)物網(wǎng)箱養(yǎng)殖的出現(xiàn)和快速發(fā)展，高密度的養(yǎng)殖方式帶來高效益的同時(shí)也伴隨著許多問題，如造成魚類的應(yīng)激增強(qiáng)而引起免疫力下降，容易爆發(fā)傳染性疾病，長期使用化學(xué)藥物防治魚病容易引起水體中病原耐藥性增加和產(chǎn)生藥物殘留等生態(tài)問題。因此，開發(fā)利用具有多功能的天然無公害的藥物，實(shí)現(xiàn)促生長、提高動(dòng)物抗氧化和免疫能力，是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)迫切需求。研究表明，多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能、抗氧化能力具有增強(qiáng)作用，如在異育銀鯽飼料中添加酵母細(xì)胞壁多糖，可提高其血清抗體效價(jià)以及血液中白細(xì)胞的吞噬能力[1]，在羅非魚的飼料中添加黃芪多糖，可以顯著提高血漿中的CAT、SOD的含量[2]。前期研究表明，雞樅菌多糖具有顯著的免疫增強(qiáng)活性[3-4]和體外抗氧化活性[5-7]，但其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的體內(nèi)免疫活性及抗氧化作用國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究旨在探討雞樅菌多糖(TAP)對(duì)鯽的肥滿度、體內(nèi)抗氧化能力及溶菌酶水平的影響，為研發(fā)新型安全高效的魚用保健品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鯽和通威鯽飼料均購自市場(chǎng)、黃芪多糖(APS)和雞樅多糖(TAP)均由西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備，丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 含藥飼料的制備

將相應(yīng)添加量的APS或TAP溶解于適量蒸餾水，對(duì)各組日糧進(jìn)行充分浸泡，待藥液被完全吸收后，于40 ℃烘干裝入密封袋備用。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理

選取(8±0.2)g的健康鯽175尾，隨機(jī)分成5組，每組35尾，分別為空白組、黃芪多糖對(duì)照組(APS添加量為日糧的1%)、TAP高、中、低劑量組(TAP添加量分別為日糧的1%、0.5%、0.1%)，日糧按各組鯽總體重的3%分為早、晚兩次投喂。分別在給藥后的第7、14天各采樣一次，每次各組隨機(jī)選取15尾魚，稱量每尾魚的體重、體長，肝胰臟和頭腎組織重量，記錄結(jié)果。

1.2.3 TAP對(duì)鯽肥滿度和肝體比的影響

魚肥滿度是魚體重量與魚體體長立方數(shù)的比值，是反映魚類肥瘦程度和生長情況的重要指標(biāo)。分別將各組給藥后的第7、14天稱量魚的體重、體長和肝胰臟重量，按以下公式計(jì)算肥滿度(K)和肝體比(HIS)。

K=(W/L3)×100

HIS=G/W×100%

式中W為體重(g)，L為體長(cm)，G為肝胰臟重量(g)。

1.2.4 鯽肝胰臟勻漿的制備

使用球磨儀每秒振動(dòng)150次，研磨30 s，按組別分別將每一尾鯽的0.1 g肝胰臟以4 ℃ 0.65%生理鹽水制備成10%的勻漿液，將勻漿液以3 000 r/m離心10 min，取上清液于4 ℃保存待測(cè)。

1.2.5 TAP對(duì)鯽肝胰臟抗氧化性能的影響

取1.2.4制備的樣品按照檢測(cè)試劑盒使用說明分別進(jìn)行各組MDA、CAT、SOD的檢測(cè)，方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 TAP對(duì)鯽免疫功能的影響

分別按以下公式計(jì)算給藥后第7和第14天各組鯽的頭腎體指數(shù)(HKBI)。HKBI=TS/W×100%，式中TS為頭腎重(g)，W為體重(g)。

取1.2.4制備的樣品按照檢測(cè)試劑盒使用說明進(jìn)行各組LZM含量的檢測(cè)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，并采用SPSS 20.0軟件中 ANOVA 模型進(jìn)行單因素方差分析，采用 LSD 方法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 TAP對(duì)鯽肥滿度和肝體比的影響

結(jié)果表明，APS及TAP各劑量組均可不同程度地提高鯽肥滿度。給藥7 d后，TAP高劑量組比空白組提高了69.2%；其余各組間差異不顯著。給藥14 d天后，各組間肥滿度差異均不顯著。結(jié)果反映了高劑量TAP在7 d內(nèi)可能對(duì)鯽有促進(jìn)生長的作用，效果優(yōu)于相同劑量的APS，結(jié)果見表1 。

表1 TAP對(duì)鯽肥滿度的影響Tab.1 Effect of TAP on fullness of C.auratus %

注：同一列上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著，P<0.01；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05 。下表同。

肝胰臟是魚體最大的消化腺，具有分泌膽汁和消化酶功能。給藥7 d后各組肝體比均高于空白組，其中APS組的肝體比提高了21.77%，TAP中劑量組的肝體比提高了21.29%，但各組間無顯著差異；給藥14 d后，各組肝體比仍然高于空白組，其中APS組的肝體比最高，比空白組提高了13.06%，而TAP中劑量組則提高了10.4%。結(jié)果表明，APS和TAP對(duì)鯽的肝胰臟的代謝有一定的影響，但這種影響在試驗(yàn)期間不顯著，可能與給藥時(shí)間較短有關(guān)，結(jié)果見表2。

表2 TAP對(duì)鯽肝體比的影響Tab.2 Effect of TAP on hepatopancreas index of C.auratus %

2.2 TAP對(duì)鯽肝胰臟抗氧化功能的影響

給藥7 d后，APS組鯽肝胰臟中的MDA含量比空白組降低了43.0%，TAP中劑量組MDA比空白組降低了35.9%，且二者相比差異不顯著；給藥14 d后，MDA含量在各組間差異均不顯著，但TAP中劑量組的MDA比空白組降低了23.6%。結(jié)果表明，1% APS與0.5% TAP給藥7 d后，可快速降低鯽肝胰臟內(nèi)MDA水平，但隨著繼續(xù)給藥，APS組MDA水平恢復(fù)正常水平，而TAP中劑量組MDA僅略有回升，仍然低于空白組，反映兩種多糖的抗氧化機(jī)制可能存在差異，結(jié)果見表3。

表3 TAP對(duì)鯽肝胰臟中MDA含量的影響Tab.3 Effect of TAP on MDA in hepatopancreas of C.auratus nmol/mg prot

用藥7天后，各組與空白組相比CAT含量均有不同程度提高，APS使肝胰臟的CAT含量提高了14.93%，TAP高、中、低劑量組則分別提高了21.24%、26.31%(P>0.05)、5.74%；用藥14 d后，APS組CAT含量提高了14.20%，TAP高、中劑量組則分別提高了34.61%、25.57%，高劑量TAP效果最好。結(jié)果表明，TAP的高、中濃度在給藥期間能持續(xù)的提高魚肝胰臟CAT水平，效果優(yōu)于APS，結(jié)果見表4 。

表4 TAP對(duì)鯽肝胰臟中CAT含量的影響Tab.4 Effect of TAP on CAT in hepatopancreas of C.auratus U/mgprot

給藥7 d后，各組與空白組相比，SOD含量均無顯著差異；TAP高劑量組的SOD含量比空白組提高了32.6%，同時(shí)比APS組提高了43.4%。給藥14 d后，APS組的SOD含量高于第7天時(shí)的水平，提高了33.3%；與空白組相比，APS組SOD含量提高了26.81%，而TAP高劑量組提高了10.05%。結(jié)果表明，APS與TAP對(duì)肝胰臟的SOD水平均有促進(jìn)其升高的趨勢(shì)，但出現(xiàn)濃度高峰的時(shí)間不一致，提示二者對(duì)SOD的影響機(jī)制可能不同，結(jié)果見表5。

表5 TAP對(duì)鯽肝胰臟中SOD含量的影響Tab.5 Effect of TAP on SOD in hepatopancreas of C.auratus U/mgprot

2.3 TAP對(duì)鯽免疫功能的影響

魚類的頭腎既是造血器官也是免疫器官。給藥7 d后，各組HKBI均有不同程度的升高；與空白組相比，APS組HKBI升高了18.1%，而TAP中劑量組的HKBI升高了27.3%。給藥14 d后，APS組的HKBI比空白組升高了44.2%；TAP高、中、低劑量組HKBI則比空白組分別升高了19.4%、32.5%、38.8%。結(jié)果表明，連續(xù)給藥14 d后1% APS和0.5%、0.1% TAP均可顯著提高鯽的免疫器官指數(shù)，且TAP的免疫增強(qiáng)效果優(yōu)于相同劑量APS，結(jié)果見表6。

表6 TAP對(duì)鯽HKBI的影響Tab.6 Effect of TAP on HKBI of C.auratus %

鯽肝胰臟中的LZM是其重要的非特異性免疫指標(biāo)。用藥7 d后，各組LZM水平均高于空白組；與空白組相比，APS組LZM提高了19.8%；而TAP高劑量組LZM水平提高58.1%；中劑量TAP組提高了34.9%；低劑量TAP組提高了11.1%。給藥14 d后，APS組的LZM含量與空白組仍然無顯著差異，TAP高劑量組則比空白組提高了27.5%；TAP的中、低劑量組LZM水平均高于空白組和APS組，但組間差異均不顯著。結(jié)果表明，1% APS對(duì)鯽肝胰臟的LZM含量沒有顯著影響，而0.5%～1% TAP對(duì)鯽非特異性免疫功能有持續(xù)的增強(qiáng)作用，結(jié)果見表7 。

表7 TAP對(duì)鯽肝胰臟中LZM含量的影響Tab.7 Effect of TAP on LZM in hepatopancreas of C.auratus μg/mL

3 討論

3.1 兩種多糖對(duì)鯽生長性能的影響

據(jù)報(bào)道，APS能夠改善齊口裂腹魚[8]、羅非魚的生長性能[2]；APS在低劑量時(shí)可延緩斑馬魚細(xì)胞的凋亡，而高劑量有抑制生長的作用[9]；但也有研究表明，APS對(duì)黃顙魚的增重率、增長率、肌肉蛋白含量、餌料系數(shù)方面均無顯著影響[10]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，1% 飼料添加量的APS對(duì)鯽的肥滿度無顯著影響，與上述結(jié)論相似；但相同劑量的TAP對(duì)鯽的肥滿度有短期提高作用，揭示TAP短期內(nèi)可能通過調(diào)節(jié)鯽的飼料利用率對(duì)鯽生長有一定促進(jìn)作用。

肝胰臟是魚類的可調(diào)節(jié)性貯脂器官，其重量反映出脂肪含量及營養(yǎng)狀態(tài)，當(dāng)飼料中的營養(yǎng)因子和抗氧化因子的影響了脂肪的代謝，其肝體比就會(huì)產(chǎn)生變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種多糖均對(duì)鯽的肝體比有提高的趨勢(shì)，這可能與其能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用有關(guān)。

3.2 多糖對(duì)鯽體內(nèi)抗氧化能力的影響

魚類在新陳代謝的過程中，體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除保持著一種動(dòng)態(tài)平衡，過多的自由基會(huì)引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而MDA是脂過氧化的主要產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性。CAT和SOD組成的抗氧化酶系統(tǒng)可清除過多的自由基，減少脂質(zhì)過氧化造成的細(xì)胞損傷。據(jù)報(bào)道，在齊口裂腹魚的飼料中添加0.06%～0.08%的黃芪多糖，可使其血清中的 LZM、SOD活力顯著高于未添加組[8]。研究表明，長期投喂1.2 g/kg黃芪多糖可顯著提高黃顙魚肝胰臟中 LZM 和 CAT 的活力，顯著降低肝胰臟中NO的含量，但對(duì)肝胰臟中SOD的活力無顯著影響[11]?？梢夾PS對(duì)不同魚類抗氧化酶的活性存在一定影響，這可能與APS的給藥劑量與時(shí)間有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，APS可降低鯽肝胰臟中的MDA水平，這可能與APS能提高其CAT、SOD活性有關(guān)，且TAP的體內(nèi)抗氧化效果優(yōu)于相同劑量APS。

3.3 多糖對(duì)鯽免疫功能的影響

免疫器官指數(shù)可代表免疫器官的發(fā)育程度，與免疫力成正比關(guān)系，是反映免疫功能的重要指標(biāo)。魚類主要的免疫器官是由淋巴樣組織構(gòu)成的頭腎，是免疫細(xì)胞及抗體產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，因此常以頭腎體指數(shù)來反映魚類的免疫器官指數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明兩種多糖均能顯著提高鯽的頭腎體指數(shù)，因而對(duì)其免疫功能有促進(jìn)作用。

溶菌酶具有殺菌作用，是魚類非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。據(jù)報(bào)道，在羅非魚的基礎(chǔ)飼料中連續(xù)56 d添加0.1%的云芝多糖時(shí)，其血清LZM的活性最高(P>0.05)，添加量為0.25% 時(shí)則顯著低于對(duì)照組[12]。同樣的云芝多糖給藥56 d，添加0.1% 到銀鯽基礎(chǔ)飼料后僅在14～21 d時(shí)對(duì)血液白細(xì)胞吞噬能力、LZM活性均有顯著促進(jìn)作用[13]。以上研究表明多糖的免疫調(diào)節(jié)作用與給藥劑量和時(shí)間有關(guān)，揭示多糖對(duì)健康魚類的非特異性免疫功能可能具有雙相調(diào)節(jié)作用或容易引起耐受。在本試驗(yàn)中，APS與TAP均可提高HKBI，但APS對(duì)LZM的影響不顯著，這可能與APS的給藥劑量和時(shí)間有關(guān)；而1% TAP可使鯽肝胰臟中LZM水平在試驗(yàn)期間均顯著高于空白組，且LZM的濃度隨著給藥時(shí)間延長也出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。此外，有研究表明，免疫活性多糖的主要成分是β-葡聚糖，而從擔(dān)子菌中提取的β-葡聚糖大多是β-1，3葡聚糖結(jié)合而成，其側(cè)鏈和殘基的分布和數(shù)量可能影響其生物學(xué)[14]。TAP是從擔(dān)子菌門的雞樅菌提取出的多糖成分，其結(jié)構(gòu)與APS不同，這可能是兩種多糖對(duì)鯽肝臟LZM的影響存在較大差異的原因。

本研究結(jié)果表明，以TAP連續(xù)給藥14 d對(duì)鯽肥滿度和肝體比均無顯著影響，而對(duì)鯽抗氧化和免疫功能有顯著的促進(jìn)作用，效果優(yōu)于相同劑量的APS，具有開發(fā)成魚用保健品的潛力。