周建設(shè)，張 馳，劉海平，馬 波，王萬良，曾本和，牟振波

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，拉薩 850032；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150000；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

裂腹魚亞科(Schizothoracinae)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)，全球約有100多種[1]，中國共計(jì)76個(gè)種和亞種，占全球裂腹魚亞科魚類的80%以上[2]，廣泛分布于西藏水系，是西藏魚類區(qū)系的優(yōu)勢群體，具有明顯的區(qū)域特性[3]，曹文宣[4]首次對(duì)中國裂腹魚亞科魚類進(jìn)行了較系統(tǒng)的整理，也為西藏水系裂腹魚的分類奠定了基礎(chǔ)。

DNA條形碼技術(shù)自用于物種鑒別體系以來，在魚類的鑒定應(yīng)用方面越來越多，尤其是在魚卵、仔稚魚等[5]通過外部形態(tài)難以辨識(shí)的物種上。Ariagna等[6]用DNA條形碼技術(shù)分析了古巴126尾淡水魚，認(rèn)為COI基因序列能夠區(qū)分本地的淡水魚，Alba等[7]對(duì)亞馬遜河大范圍銷售的“Acará”進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)是由7個(gè)物種組成，Brito等[8]用DNA條形碼對(duì)137個(gè)石首魚科進(jìn)行了鑒定，鑒定率達(dá)到90%。在西藏部分及其毗鄰地區(qū)以裂腹魚亞科屬間系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、生物地理學(xué)和進(jìn)化中的隔離事件為主線的研究多以線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因?yàn)榛A(chǔ)[9]，比較系統(tǒng)、全面、客觀地探討了裂腹魚亞科魚類的起源、演化、擴(kuò)散等與青藏高原的不斷隆升事件的關(guān)系，而涉及分類學(xué)和物種鑒定的討論并不多，尤其是限定在西藏水系裂腹魚亞科屬間魚種的鑒定鮮有報(bào)道，產(chǎn)久林等[10]對(duì)采自拉薩市羊卓雍措的60尾5種高原裂腹魚進(jìn)行了基于COI和16 S rRNA基因部分序列的物種鑒定，表明COI基因能有效鑒定高原裂腹魚魚種。

西藏水系格局復(fù)雜，河流縱橫交錯(cuò)，高原湖泊星羅棋布，裂腹魚亞科魚類作為西藏水系優(yōu)勢種群，魚類可能存在不同水域遷移和同一水域種間雜交，出現(xiàn)形態(tài)相似不同種和同種魚不同形態(tài)的現(xiàn)象。近年來，雅魯藏布江魚類資源受到嚴(yán)重威脅[11]，對(duì)其魚類資源的養(yǎng)護(hù)迫在眉睫，摸清西藏水系魚類資源現(xiàn)狀，確定優(yōu)勢物種、普通物種和瀕危物種，制定合理的養(yǎng)護(hù)措施，對(duì)西藏水系所有魚類進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定顯得尤為重要，而傳統(tǒng)的魚類鑒定方法具有一定的局限性[12]，歷史上在裂腹魚亞科魚類各屬的界定中也不盡相同[2，13]，事實(shí)也說明西藏水系現(xiàn)存裂腹魚種類繁多，一部分種間形態(tài)學(xué)差異不明顯，尤其在幼魚期和裸鯉屬內(nèi)種間表型極其相似。因此，從分子角度對(duì)西藏水系裂腹魚亞科魚類的鑒定顯得尤為重要，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)西藏水系的裂腹魚亞科魚類進(jìn)行種類鑒定鮮有報(bào)道。本研究是基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶1(COI)基因序列的DNA條形碼技術(shù)，以目前能捕獲的西藏水系裂腹亞科魚類為研究對(duì)象，展開DNA條形碼研究，驗(yàn)證COI基因序列對(duì)采自中國西藏水系的裂腹魚亞科魚類樣本進(jìn)行物種鑒定的適用性，對(duì)于西藏水系裂腹魚亞科魚類種類鑒定，摸清西藏地區(qū)魚類資源現(xiàn)狀，制定合理的魚類養(yǎng)護(hù)進(jìn)程具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究中，所采集到的裂腹魚亞科魚類形態(tài)鑒定主要依據(jù)樂佩琦等[13]的分類體系及其對(duì)各物種的形態(tài)描述。在西藏水域共采集到裂腹魚亞科包括5屬20種的260個(gè)樣本，其中包括裂腹魚屬(Schizothorax)的107個(gè)樣本，尖裸鯉屬(Oxygymnocypris)30個(gè)樣本，裸鯉屬(Gymnocypris)32個(gè)樣本，葉須魚屬(Ptychobarbus)22個(gè)樣本，裸裂尻屬(Schizopygopsis)69個(gè)樣本，代表了西藏水域現(xiàn)能采集到的大部分裂腹魚亞科的魚種。本研究中所測物種均采集于2014—2017年間，野外采樣時(shí)，取鰭條組織保存在70%的酒精中，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品DNA提取

采用傳統(tǒng)氯仿法從鰭條中提取DNA。

1.3 線粒體基因組COI基因片段擴(kuò)增和測序

COI基因片段PCR擴(kuò)增的引物為F(5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′)，L(5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′)[10]。引物由美因基因公司合成。PCR反應(yīng)體系為5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μmol/L)0.8 μL，Reverse Primer(5 μmol/L)0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃，5 min，95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，45 s，27個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增儀為ABI GeneAmpR9700型。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠(2%)電泳5 V/cm，20 min，凝膠圖片經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測陽性后送美因基因公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分段進(jìn)行正反鏈雙向測序的數(shù)據(jù)經(jīng)CHROMAS軟件比對(duì)后，適當(dāng)進(jìn)行人工校對(duì)，然后用DNAMAN軟件進(jìn)行分段數(shù)據(jù)的拼接，所有COI序列利用CLUSTAL X2.1軟件的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置為基礎(chǔ)進(jìn)行同源序列的多重比對(duì)，并實(shí)施人工校對(duì)。比對(duì)后的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，檢索相似性，確定物種分類地位。依據(jù)物種COI序列相似度達(dá)到99%以上認(rèn)定為同一種，相似度92%～99%為同一屬，83%～92%為同一科[14]。通過Mega5.0軟件分析序列的堿基組成及其變異位點(diǎn)等統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算序列Kimura雙參數(shù)種內(nèi)及種間個(gè)體間遺傳距離，在物種鑒定中，遺傳距離以0.02作為種內(nèi)及種間的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[15，16]，采用鄰接法(Neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建分析系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過Bootstrap檢驗(yàn)聚類樹各分支的置信度，系統(tǒng)發(fā)育樹中的斷線脂鯉(Phenacogrammusinterruptus)和墨西哥麗脂魚(Astyanaxmexicanus)為外群[17]。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)所采集的西藏水系裂腹魚亞科260個(gè)樣本經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定(表1)，包括裂腹魚屬10個(gè)種的拉薩裂腹魚(S.racomawaltoni)31尾，異齒裂腹魚(S.schizothoraxo'connori)38尾，巨須裂腹魚(S.macropogon)31尾，長絲裂腹魚(S.schizothoraxdolichonema)、瀾滄江裂腹魚(S.racomalantsangensis)、怒江裂腹魚(S.schizothoraxnukiangensis)、西藏裂腹魚(S.labiatus)、墨脫裂腹魚(S.molesworthi)、橫口裂腹魚(S.plagiostomus)、弧唇裂腹魚(S.curvilabiatus)各1尾；尖裸鯉屬1個(gè)種的尖裸鯉(O.stewaritii)30尾；裸鯉屬4個(gè)種的蘭格胡裸鯉(G.chui)29尾，納木錯(cuò)裸鯉(G.namensis)、硬刺裸鯉(G.firmispinatus)、色林錯(cuò)裸鯉(G.selincuoensis)各1尾；葉須魚屬3個(gè)種的雙須葉須魚(P.dipogon)20尾，錐吻葉須魚(P.conirostris)、裸腹葉須魚(P.kaznakovi)各1尾；裸裂尻魚屬2個(gè)種的拉薩裸裂尻(S.younghusbandi)34尾，高原裸裂尻(S.stoliczkai)35尾。

表1 樣本采集信息Tab.1 The collection information of samples

續(xù)表

2.2 COI基因序列特征

西藏水域裂腹魚亞科魚類COI基因片段經(jīng)比對(duì)和人工校對(duì)后，序列長度為620 bp。包括外群所分析的262條序列620個(gè)位點(diǎn)中，有225個(gè)可變位點(diǎn)(無插入或缺失)，其中161個(gè)為簡約性位點(diǎn)，64個(gè)為單突變位點(diǎn)，信息位點(diǎn)最多的是第二位密碼子(142個(gè)簡約性信息位點(diǎn))，第三位密碼子次之(18個(gè)簡約性信息位點(diǎn))，而第一位密碼子最少(1個(gè)簡約性信息位點(diǎn))。序列的堿基組成為A=25.74%、T=29.00%、C=27.44%、G=17.81%，平均轉(zhuǎn)換/顛換值為8.754。裂腹魚亞科內(nèi)群260條序列620 bp位點(diǎn)中，有162個(gè)可變位點(diǎn)(無插入或缺失)，其中143個(gè)為簡約性位點(diǎn)，19個(gè)為單突變位點(diǎn)，序列的堿基組成為A=25.76%、T=28.98%、C=27.44%、G=17.82%，平均轉(zhuǎn)換/顛換值為8.899。裂腹魚亞科COI基因片段G+C含量見表2，堿基組成表現(xiàn)出反G偏倚的線粒體基因組的典型特征。

表2 裂腹魚亞科魚類不同密碼子位堿基組成Tab.2 The comprises of base different codon position of Schizothroachinae %

2.3 遺傳距離計(jì)算

基于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，本研究中構(gòu)建了西藏水域裂腹魚DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，通過本地?cái)?shù)據(jù)庫和GenBank雙重比對(duì)進(jìn)行鑒定。計(jì)算260個(gè)樣本種內(nèi)及種間遺傳距離，根據(jù)種內(nèi)及種間遺傳距離進(jìn)行分組，分組原則是種內(nèi)樣本間遺傳距離小于0.02，種間樣本間遺傳距離大于0.02，根據(jù)這一原則，260個(gè)個(gè)體共分為10組(表3)。對(duì)比形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，Gp 1包含29尾拉薩裂腹魚、38尾異齒裂腹魚、29尾巨須裂腹魚、1尾弧唇裂腹魚和1尾長絲裂腹魚；Gp2包含1尾納木錯(cuò)裸鯉、1尾硬刺裸鯉、1尾色林錯(cuò)裸鯉、9尾蘭格湖裸鯉、34尾拉薩裸裂尻、4尾尖裸鯉和2尾拉薩裂腹魚；Gp 3包含35尾高原裸裂尻和20尾蘭格湖裸鯉；Gp 4包含26尾尖裸鯉；Gp5包含20尾雙須葉須魚和3尾巨須裂腹魚；Gp6包含1尾怒江裂腹魚和1尾瀾滄江裂腹魚；Gp7包含1尾西藏裂腹魚和1尾橫口裂腹魚；Gp8包含1尾錐吻葉須魚；Gp9包含1尾裸腹葉須魚；Gp10包含1尾墨脫裂腹魚。10個(gè)組中每個(gè)種隨機(jī)選取個(gè)體序列在NCBI中調(diào)用Blast程序進(jìn)行比對(duì)以確定其種。

表3 260個(gè)樣本根據(jù)遺傳距離分組及鑒定結(jié)果Tab.3 The grouping and the identification results of 260 individuals based on genetic distance

通過Blast，Gp1中的弧唇裂腹魚和長絲裂腹魚，Gp2中的納木錯(cuò)裸鯉、硬刺裸鯉、色林錯(cuò)裸鯉、拉薩裂腹魚，Gp6中的怒江裂腹魚、瀾滄江裂腹魚，Gp7中的西藏裂腹魚、橫口裂腹魚由于數(shù)據(jù)缺失以及數(shù)據(jù)庫中存在可信度較高的多個(gè)命名，只能鑒定到屬水平。

考慮到各組中包含了由形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的多個(gè)魚種，并且有些魚種在形態(tài)特征上差異比較明顯，因此，對(duì)各組中個(gè)體數(shù)量大于1的魚種按形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果再分組，計(jì)算組內(nèi)及組間遺傳距離用于進(jìn)一步分析(表4)。

表4 組內(nèi)及組間平均遺傳距離Tab.4 The average genetic distance of with-in group and inter block

注：對(duì)應(yīng)表3，Gp1-1為異齒裂腹魚；Gp1-2為拉薩裂腹魚；Gp1-3為巨須裂腹魚；Gp2-1為拉薩裸裂尻；Gp2-2為蘭格湖裸鯉；Gp2-3為尖裸鯉；Gp2-4為拉薩裂腹魚；Gp3-1為高原裸裂尻；Gp3-2為蘭格湖裸鯉；Gp5-1 為雙須葉須魚；Gp5-2為巨須裂腹魚。

對(duì)各組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Gp1中Gp1-1(異齒裂腹魚)、Gp1-2(拉薩裂腹魚)和Gp1-3(巨須裂腹魚)之間形態(tài)特征具有明顯的差異，再分組發(fā)現(xiàn)，組間遺傳距離均大于0.01，組內(nèi)遺傳距離均小于0.01，其中組間遺傳距離最小的是Gp1-1和Gp1-3，為0.011，組內(nèi)平均遺傳距離Gp1-1和Gp1-3均為0.001，組間遺傳距離是組內(nèi)遺傳距離的11倍，Blast結(jié)果與再分組鑒定結(jié)果一致。Gp2中Gp2-1(拉薩裸裂尻)、 Gp2-2(蘭格湖裸鯉)和Gp2-3(尖裸鯉)之間形態(tài)特征差異不明顯，且遺傳距離分析沒有明顯特征，Gp2-4為拉薩裂腹魚，但拉薩裂腹魚與該組中其他魚種形態(tài)差異較大，由于樣本時(shí)間收集跨度大，查證原始數(shù)據(jù)確定是樣本分裝時(shí)記錄出錯(cuò)，且Blast結(jié)果證實(shí)該2個(gè)樣本為裸鯉屬，但存在多個(gè)命名。Gp2-1、Gp2-3經(jīng)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大部分命名為羊卓雍措高原裸鯉，Gp2-2為軟刺裸鯉，均屬裸鯉屬，可信度均為100%。Gp3中Gp3-1(高原裸裂尻)和Gp3-2(蘭格湖裸鯉)遺傳距離分析沒有明顯特征，經(jīng)Blast兩種均在高原裸裂尻魚。Gp 5中Gp 5-1(雙須葉須魚)和Gp 5-2數(shù)據(jù)記錄為巨須裂腹魚，但巨須裂腹魚與該組中其他魚種形態(tài)差異較大，由于樣本時(shí)間收集跨度大，查證原始數(shù)據(jù)確定是樣本分裝時(shí)記錄出錯(cuò)，Blast結(jié)果證實(shí)3個(gè)巨須裂腹魚為雙須葉須魚，可信度為99%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

基于表3中的分組，每組中選取各物種代表性序列，總共24條，采用鄰接法(Neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過Bootstrap檢驗(yàn)聚類樹各分支的置信度，系統(tǒng)發(fā)育樹中的斷線脂鯉和墨西哥麗脂魚為外群，見圖1。

圖1 裂腹魚亞科系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of Schizothroacinae in Tibet water system

對(duì)應(yīng)表3，圖中不同的顏色區(qū)域代表不同的屬，箭頭所示為各個(gè)屬分支Bootstrap檢驗(yàn)支持率。

圖1中，粉紅色區(qū)域?qū)?yīng)表3中的Gp2組，為裸鯉屬，Bootstrap檢驗(yàn)支持率為99%；淡藍(lán)色區(qū)域?qū)?yīng)表3中的Gp3組，為裸裂尻魚屬；支持率為100%，淡綠色區(qū)域?qū)?yīng)表3中的Gp5、Gp8、Gp9組，為葉須魚屬，支持率為100%；淺灰色區(qū)域?qū)?yīng)表3中的Gp1、Gp6、Gp7、Gp10組，為裂腹魚屬，支持率為100%；淡黃色區(qū)域?qū)?yīng)表3中的Gp4組，為尖裸鯉屬。斷線脂鯉和墨西哥麗脂魚為外群。裂腹魚亞科魚類形成一個(gè)支持率較高的單系群，Bootstrap檢驗(yàn)支持率為99%。裂腹魚亞科魚類形成三個(gè)主要族群，族群I僅包括裂腹魚屬，Bootstrap檢驗(yàn)支持率為100%，族群II僅包括葉須魚屬，Bootstrap檢驗(yàn)支持率為100%，族群III包括裸鯉屬、裸裂尻魚屬和尖裸鯉屬，Bootstrap檢驗(yàn)支持率為72%。系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類方式與表3的分組方式及鑒定結(jié)果高度一致。

3 討論

3.1 裂腹魚亞科的形態(tài)學(xué)鑒定

本研究中的魚類標(biāo)本是在2014—2017年間所采集，采集到的魚類以形態(tài)學(xué)鑒定共260尾，分屬為5屬20個(gè)種，均為裂腹魚亞科，260尾個(gè)體種，249尾以分子生物學(xué)手段鑒定到了種水平，鑒出率為95.8%，179尾分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，一致率為68.8%。在野外采樣時(shí)，由于條件的限制，不能對(duì)所采集魚類進(jìn)行細(xì)致的形態(tài)學(xué)觀察，尤其是裸鯉屬的魚類大多表觀形態(tài)極為相似，不能準(zhǔn)確鑒定到種，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)在對(duì)物種的分類過程中耗時(shí)耗力，并且有些物種由于環(huán)境的差異使同一種類的物種呈現(xiàn)顯著的形態(tài)學(xué)差異等[18]，這都會(huì)給物種的鑒定帶來一定的困難。在裂腹魚亞科魚類的分類過程中，也在不斷修正，1962年，曹文宣等澄清了1個(gè)屬名和8個(gè)種的同物異名[19]，1964年又合并了20個(gè)同物異名[4]，此后，張春霖等[20]、武云飛等[21]、陳毅峰等[5]均對(duì)西藏魚類的分類進(jìn)行了深入的研究，并修正了以往混亂的分類體系。由于物種間形態(tài)特征的模糊及分析樣本量的限制，在裂腹魚類個(gè)別種屬的界定方面認(rèn)為有些屬并未形成單系群[11]，說明在裂腹魚亞科個(gè)別種屬的界定方面仍存在較大爭議，這與本研究中裸鯉屬中種的界定比較混亂是一致的，而且，在形態(tài)特征相似物種的鑒定過程中，主觀意志的存在也是不可避免的，本研究中拉薩裸裂尻魚并未與高原裸裂尻歸為一類，而歸為裸鯉屬，可能是形態(tài)學(xué)鑒定過程中的差異造成，若非形態(tài)學(xué)鑒定的錯(cuò)誤，那么很有可能拉薩裸裂尻在分類學(xué)中本該歸于裸鯉屬，具體如何界定拉薩裸裂尻，在本研究中還需要補(bǔ)充裸鯉屬其他種類的樣本量。

3.2 DNA條形碼在裂腹魚亞科物種鑒定中的有效性

本研究中對(duì)所采集的260尾裂腹魚亞科魚類以組內(nèi)遺傳距離值小于0.02，組間遺傳距離值大于0.02為原則，進(jìn)行了分子生物學(xué)的鑒定，并與現(xiàn)場采集時(shí)形態(tài)特征鑒定的結(jié)果進(jìn)行了互相印證。以遺傳距離值為0.02為西藏水系裂腹魚亞科物種鑒定的閾值在裂腹魚屬、裸鯉屬的鑒定中具有一定的局限性。不同物種COI基因進(jìn)化速率可能是不一致的，因此，使用DNA條形碼進(jìn)行物種的鑒定中，統(tǒng)一的遺傳距離的閾值很難確定[22，23]，本研究中，異齒裂腹魚、拉薩裂腹魚和巨須裂腹魚之間以0.02作為遺傳距離閾值，這3種魚鑒定為一個(gè)種，事實(shí)上，它們?cè)谛螒B(tài)特征上具有比較明顯的差異，而將其遺傳距離閾值設(shè)定為0.01，則這3種魚可以有效地得到區(qū)分。由于環(huán)境的影響，生存在不同水域的同一種魚在形態(tài)特征上可能表現(xiàn)出較大的差異，而被認(rèn)為是不同物種，但這些魚類的基因序列在進(jìn)化中并未表現(xiàn)出明顯差異，Mohd Shamsudin等[24]研究表明龍魚的體色變化與COI基因分化程度沒有關(guān)系，陳信忠等[25]通過檢索BOLD SYSTEMS和GenBank數(shù)據(jù)庫中慈鯛、神仙魚等觀賞魚的COI基因，檢驗(yàn)DNA條形碼在觀賞魚物種鑒定中的應(yīng)用，表明這些觀賞魚由于頻繁雜交，親本的多樣性等，COI基因相似性非常高，遺傳距離小于0.01，使得DNA條形碼難以鑒別這些魚類。本研究中，裸鯉屬種間遺傳距離均小于0.01，最大為0.005，怒江裂腹魚和瀾滄江裂腹魚種間平均遺傳距離為0.002，西藏裂腹魚和橫口裂腹魚種間平均遺傳距離為0.000，弧唇裂腹魚和長絲裂腹魚與異齒裂腹魚之間的遺傳距離均小于0.001，因此，本研究中DNA條形碼在這些魚種間不能被有效區(qū)分。由于西藏水系縱橫交錯(cuò)復(fù)雜，這些魚類可能存在物種間的雜交種，或是同一物種在不同生存地理環(huán)境當(dāng)中表現(xiàn)出的形態(tài)差異，比如蘭格湖裸鯉和硬刺裸鯉均生活在蘭格湖中，怒江和瀾滄江均屬于長江水系，西藏裂腹魚和橫口裂腹魚均采自雅魯藏布江上游水系，長絲裂腹魚和弧唇裂腹魚均采自雅魯藏布江下游水系等生存環(huán)境和水系的影響可能使這些魚類COI基因序列分化程度較低，也有同物異名存在的可能性。由于本研究中樣本收集時(shí)間跨度較大，在樣本整理過程中，存在樣本分裝、標(biāo)記等人為失誤，然而，通過COI基因片段可以將這部分樣本有效區(qū)分。本研究中通過Blast程序比對(duì)后，裸鯉屬中除羊卓雍措高原裸鯉外，其他均具多個(gè)命名，樣本數(shù)只有1個(gè)的裂腹魚屬也具多個(gè)命名，事實(shí)上裸鯉屬由于在形態(tài)上極為相似，在以往文獻(xiàn)中的分類也是比較混亂的，提示裸鯉屬內(nèi)種間可能存在同種異名的情況，而樣本數(shù)只有1個(gè)的裂腹魚屬中的幾個(gè)種，在西藏水系中屬非常見種，樣本收集量本來就少，數(shù)據(jù)庫中記錄也很有限，且數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)也不一定是正確的。因此，本研究下一步將繼續(xù)應(yīng)用分子生物學(xué)鑒定手段，積累樣本，著重分析上述問題。本研究中所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹直觀地反映了以遺傳距離閾值為0.02對(duì)裂腹魚亞科鑒定分類結(jié)果，族群I作為原始族群置于發(fā)育樹底部，而族群III以特化群置于發(fā)育樹頂部。雖然線粒體DNA在物種鑒定中與形態(tài)學(xué)鑒定存在不一致性，但是能夠很好地反映水系間的地理和歷史聯(lián)系，總體上相近的水系的物種具有更近的親緣關(guān)系[26]。本研究中，采自長江水系的怒江裂腹魚和瀾滄江裂腹魚以100%的支持率聚在一支，采自雅魯藏布江上游水系的西藏裂腹魚和橫口裂腹魚以100%的支持率聚在一支，采自雅魯藏布江下游水系的長絲裂腹魚和弧唇裂腹魚以90%的支持率聚在一支。本研究中分析結(jié)果及推理仍受限于部分魚種標(biāo)本單一的事實(shí)，無法進(jìn)行深入分析，這也是下一步需要開展的工作。