王佳佳 馮文莉

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，太原 030001)

白念珠菌是一種常見的條件致病性真菌，常寄居于人體的皮膚黏膜，由于菌株毒力的增加、宿主免疫力降低、外部環(huán)境改變等因素可導(dǎo)致人體淺表真菌感染或系統(tǒng)性真菌感染[1]。通過對(duì)中國(guó)西南地區(qū)的念珠菌血癥患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)白念珠菌的感染比例為34.9%，是導(dǎo)致念珠菌血癥的主要菌種[2]。目前治療白念珠菌感染主要以唑類、多烯類、嘧啶類和棘白菌素類抗真菌藥物為主。但由于抗真菌藥的長(zhǎng)期使用，臨床上可以見到許多抗真菌治療失敗的案例，分析其主要原因就是真菌耐藥性的增加。白念珠菌生物膜的形成是真菌藥耐藥性明顯增加的重要原因之一，有研究顯示，真菌生物膜比浮游細(xì)胞耐藥性高1000 倍左右[3]。

白念珠菌生物膜耐藥機(jī)制主要為[4]：細(xì)胞外基質(zhì)作為一個(gè)物理屏障阻礙藥物的進(jìn)入；生物膜內(nèi)細(xì)胞活性下降，對(duì)抗真菌藥物不敏感；耐藥基因的表達(dá)增加，如外排泵基因CDR1和MDR1、麥角甾醇合成途徑中ERG11和ERG25等基因的表達(dá)量上調(diào)；生物膜內(nèi)滯留菌的長(zhǎng)期存在等，這些因素均可以導(dǎo)致白念珠菌生物膜耐藥性的增強(qiáng)。其中滯留菌在白念珠菌生物膜耐藥機(jī)制中的作用越來越突出。Fauvart等[5]發(fā)現(xiàn)臨床上出現(xiàn)許多慢性難治性感染，大部分與滯留菌的存在有關(guān)，滯留菌可以作為慢性難治性白念珠菌感染治療的一個(gè)新的突破點(diǎn)。此外，饑餓狀態(tài)下滯留菌的形成比例增加[12]，而且轉(zhuǎn)錄基因GCN4表達(dá)增加[15]，所以滯留菌的形成與轉(zhuǎn)錄基因GCN4可能具有一定的相關(guān)性。

1 滯留菌

白念珠菌滯留菌(Persister cells)是生物膜隨機(jī)產(chǎn)生的少量處于休眠狀態(tài)的酵母型細(xì)胞，數(shù)量約占0.1%～1%，它們對(duì)抗真菌藥物具有較強(qiáng)的耐受性，能夠在高濃度抗真菌藥物存在的條件下存活；當(dāng)對(duì)滯留菌進(jìn)行重新培養(yǎng)時(shí)，它可以重新構(gòu)建相似比例的新生物膜，并具有相同的抗真菌藥物敏感性[6]。

1.1 滯留菌與耐藥性

白念珠菌生物膜耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，滯留菌作為其中的一個(gè)重要機(jī)制，越來越引起大家的關(guān)注。Del Pozo等[7]發(fā)現(xiàn)最成熟的抗真菌藥耐藥機(jī)制是生物膜中的微生物亞群采用獨(dú)特的、高度保護(hù)的表型狀態(tài)，即滯留菌。滯留菌與耐藥菌有所不同：基因序列并沒有發(fā)生任何改變，耐藥性不會(huì)遺傳[8]。它可通過“休眠-生長(zhǎng)-增殖”的方式應(yīng)對(duì)不良環(huán)境，維持自身生存和菌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Vogwill等[9]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滯留菌與耐藥菌之間代表的是一種互補(bǔ)的、而非競(jìng)爭(zhēng)性的進(jìn)化策略；當(dāng)抗生素的暴露時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，將有利于耐藥菌的產(chǎn)生；如果抗生素暴露時(shí)間短暫，將有利于滯留菌的產(chǎn)生。滯留菌處于持久性休眠狀態(tài)時(shí)，它幾乎不發(fā)生細(xì)胞壁合成、翻譯或產(chǎn)生拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，所以抗真菌藥物能夠與其結(jié)合但不破壞其靶分子的功能[7]。因此，與細(xì)菌中的滯留菌一樣，白念珠菌滯留菌表現(xiàn)出非遺傳性、多藥耐受性的特征，被認(rèn)為是高抗生素耐藥性和真菌感染性疾病復(fù)發(fā)的主要決定因素[10]。

1.2 滯留菌與生物膜

滯留菌與生物膜之間存在密切的聯(lián)系。雖然浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)下都能檢測(cè)到細(xì)菌性滯留菌[11]，但白念珠菌滯留菌迄今僅在生物膜中被觀察到[6]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)缺乏(饑餓狀態(tài))對(duì)白念珠菌生物膜形成具有一定影響[12]：對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和饑餓態(tài)白念菌生物膜形成能力依次下降，且對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期形成菌絲相生物膜，饑餓狀態(tài)下形成酵母相生物膜；此外，給予抗真菌藥物作用后，滯留菌比例依次升高；說明饑餓狀態(tài)能夠形成酵母相生物膜，且提高滯留菌的產(chǎn)生比例。而且Sun等通過研究[13]，再次確認(rèn)只有在生物膜中才能觀察到白念珠菌滯留菌，而浮游狀態(tài)完全沒有滯留菌的存在；并發(fā)現(xiàn)白念珠菌滯留菌主要在生物膜形成的表面黏附階段產(chǎn)生(生物膜形成的0～2 h)， 表明表面黏附是形成和維持白念珠菌滯留菌所必需的。

2 轉(zhuǎn)錄基因GCN4

GCN4(又名：CaO19.1358基因)是一種氨基酸饑餓應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，位于白念珠菌第2號(hào)染色體，長(zhǎng)度約為1468個(gè)堿基對(duì)，它與啟動(dòng)元件TGACTC相結(jié)合，參與了包括編碼氨基酸生物合成酶系各基因在內(nèi)的表達(dá)調(diào)節(jié)[14]。大多數(shù)酵母在任何一種氨基酸饑餓的生長(zhǎng)環(huán)境中均可激活GCN2，使eIF2磷酸化，抑制大多數(shù)蛋白質(zhì)的生物合成，并特異性增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄基因GCN4的合成[15]。

2.1 轉(zhuǎn)錄基因GCN4與耐藥性

白念珠菌的耐藥機(jī)制除了耐藥基因的表達(dá)增加外，還進(jìn)化出了應(yīng)激反應(yīng)途徑，使細(xì)胞能夠應(yīng)對(duì)環(huán)境中存在的各種壓力[16]，如氧化應(yīng)激反應(yīng)等。白念珠菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)是由翻譯起始的氧化特異性調(diào)控介導(dǎo)的，Sundaram等[17]發(fā)現(xiàn)包括過氧化氫、重金屬鎘和硫醇氧化劑在內(nèi)的氧化劑能夠抑制翻譯起始，且都以劑量依賴性的方式抑制白念珠菌的生長(zhǎng)；除了抑制全部的翻譯起始外，eIF2a磷酸化還通過翻譯調(diào)控機(jī)制增強(qiáng)了酵母中GCN4mRNA的表達(dá)，對(duì)白念珠菌GCN4的產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用，而且GCN4是白念珠菌對(duì)過氧化氫產(chǎn)生耐受性所必須的，所以GCN4在參與白念珠菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)的同時(shí)，對(duì)白念珠菌的耐藥性也產(chǎn)生了影響。GCN4是一種參與氨基酸內(nèi)部穩(wěn)態(tài)信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，與酵母中約70%的MFS-MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[18]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，酵母對(duì)苯甲酸的反應(yīng)和耐受涉及到一種多耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tpo1，而它主要受轉(zhuǎn)錄因子GCN4和STP1的調(diào)控[19]。所以，轉(zhuǎn)錄基因GCN4與白念珠菌耐藥性密切相關(guān)。

2.2 轉(zhuǎn)錄基因GCN4與生物膜

氨基酸饑餓條件可以促進(jìn)白念珠菌的形態(tài)發(fā)生變化，包括菌絲分化和生物膜的形成，從而影響白念珠菌毒力[20]。而GCN4作為一種氨基酸饑餓應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，在白念珠菌中誘導(dǎo)了兩個(gè)不同的過程來響應(yīng)氨基酸饑餓：激活氨基酸生物合成和觸發(fā)形態(tài)變化[21]。Sundaram等[21]測(cè)試了白念珠菌gcn4/gcn4突變株與野生株在微發(fā)酵劑中形成生物膜的能力，發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，兩種菌株產(chǎn)生的生物膜總量及酵母和菌絲形成的比例相似，說明GCN4對(duì)生物膜的形成作用與觸發(fā)形態(tài)變化無關(guān)；而在營(yíng)養(yǎng)不足造成氨基酸饑餓時(shí)，突變株的生物膜生長(zhǎng)細(xì)胞比例明顯降低；證明氨基酸饑餓狀態(tài)下，生物膜的有效生長(zhǎng)離不開轉(zhuǎn)錄因子GCN4。所以，氨基酸饑餓的條件下[22]，GCN4對(duì)生物膜形成的影響類似于GCN反應(yīng)(GCN-like response,即激活氨基酸生物合成)，雖然在浮游生物種群沒有觀察到這種反應(yīng)，但生物膜的情況可能有所不同，它們似乎對(duì)蛋白質(zhì)合成的需求增加了，因此氨基酸限制可能出現(xiàn)地更快。在這些條件下，GCN4的調(diào)節(jié)作用對(duì)生物膜的形成起決定性作用。

3 滯留菌與轉(zhuǎn)錄基因GCN4的相互聯(lián)系

白念珠菌滯留菌和轉(zhuǎn)錄基因GCN4均與營(yíng)養(yǎng)環(huán)境相關(guān)。如在饑餓狀態(tài)下，能夠提高白念珠菌滯留菌的產(chǎn)生比例；而且在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，必然會(huì)造成氨基酸的相對(duì)不足，而在氨基酸饑餓狀態(tài)下，可以使轉(zhuǎn)錄基因GCN4表達(dá)量上調(diào)。

滯留菌的形成與環(huán)境的微妙變化相關(guān)[23]。在營(yíng)養(yǎng)缺乏等不適宜生存的條件下，Li等[24]通過分析白念珠菌生物膜滯留菌基因和蛋白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)滯留菌的存在的原因可能是：能夠持久下調(diào)主要的能量生成途徑和蛋白質(zhì)合成，并增強(qiáng)與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的緊張性代謝活動(dòng)和蛋白質(zhì)表達(dá)。具體如：在營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境下[24]，白念珠菌生物膜滯留菌通過抑制糖酵解和TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))的催化酶，導(dǎo)致NADH的產(chǎn)生減少，并且通過電子傳遞鏈的氧化刺激超氧化物和下游ROS的產(chǎn)生，能夠持久下調(diào)主要的能量生成途徑；降低與蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的高度保守蛋白質(zhì)Tma19的表達(dá)；下調(diào)翻譯時(shí)促進(jìn)多肽鏈延伸的主要延伸因子(如EF-1、EF-2)等。總之，這些數(shù)據(jù)表明白念珠菌生物膜的滯留菌似乎進(jìn)入了代謝不活躍狀態(tài)以生存。此外，白念珠菌生物膜滯留菌還啟動(dòng)主動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[24]，應(yīng)激反應(yīng)所必需的許多蛋白質(zhì)豐度的大幅度增加，表明白念珠菌生物膜滯留菌可能采取積極的防御策略來應(yīng)對(duì)極端的抗真菌刺激，如主導(dǎo)表型轉(zhuǎn)換(如BMH1、RAS1和ASC1)，表面黏附(如ALS3、MP65和CSP37)，群體感應(yīng)和細(xì)胞周期控制(如SMT3、SLK19和GRP2)的各種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平增加。這些調(diào)節(jié)蛋白的激活表明，白念珠菌生物膜滯留菌可能通過調(diào)節(jié)它們的生長(zhǎng)以及與其他細(xì)胞的相互作用來為自我保護(hù)模式做好準(zhǔn)備。

國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在致死劑量的兩性霉素B的作用下，抑制核酸生物合成對(duì)白念珠菌生物膜內(nèi)的滯留菌的形成影響不大[25]。國(guó)外發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行關(guān)于大腸桿菌對(duì)氨基糖苷耐受性研究時(shí)，氨基酸生物合成有助于耐受慶大霉素的大腸桿菌滯留菌的形成[26]，而且在研究AldB(醛脫氫酶)根據(jù)環(huán)境壓力控制大腸桿菌滯留菌的形成時(shí)發(fā)現(xiàn)，同樣的菌株在氨基酸有限的條件下產(chǎn)生了更多的滯留菌[27]。GCN4作為一種氨基酸饑餓應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，在參與氨基酸生物合成的同時(shí)，也必然與滯留菌的形成相關(guān)。而且，Mittal等[28]發(fā)現(xiàn)GCN4抑制了整體翻譯水平，翻譯起始因子IFs和延伸因子EFs的豐度被降低，而氨基酸生物合成中涉及的多條通路都被顯著上調(diào)，通過分析各種酵母菌株的信使RNA和蛋白質(zhì)豐度、核糖體占用率和蛋白質(zhì)合成率，證明GCN4對(duì)白念珠菌滯留菌的存在有不可替代的作用，它可能減少了其他途徑的蛋白質(zhì)合成，延長(zhǎng)白念珠菌的壽命，使滯留菌能夠存活。

4 總 結(jié)

白念珠菌是一種常見的真菌病原體，常寄居于人體內(nèi)，當(dāng)人體免疫力降低、外部環(huán)境改變時(shí)可轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?，從而引起淺表感染或系統(tǒng)性感染。滯留菌是處于非生長(zhǎng)狀態(tài)的菌細(xì)胞，被認(rèn)為是導(dǎo)致對(duì)多種藥物耐藥的主要原因，與臨床上許多慢性難治性感染息息相關(guān)。目前對(duì)于滯留菌引起的慢性難治性白念珠菌感染的治療尚處于探索階段，了解滯留菌的相關(guān)形成機(jī)制十分重要。在本文中對(duì)白念珠菌滯留菌與轉(zhuǎn)錄基因GCN4的關(guān)系的進(jìn)行了分析，希望對(duì)了解滯留菌的形成機(jī)制有所幫助。白念珠菌滯留菌的抗真菌耐受性可能是由微妙的代謝調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)的壓力適應(yīng)引發(fā)的，了解滯留菌對(duì)治療慢性難治性白念珠菌感染意義深遠(yuǎn)。一旦滯留菌形成機(jī)制明朗，將推動(dòng)滯留菌清除方面的研究，有助于新型抗真菌藥物的研發(fā)，由滯留菌引起的慢性難治性白念珠菌感染也將取得新的研究進(jìn)展。