王光裕 陳敏 洪南 王升啟 廖萬清 楊英

(1.軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點實驗室；上海長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003；3.北京市藥品檢驗所，北京 100035)

近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素在臨床的大量使用，腫瘤、艾滋病、骨髓移植和器官移植等免疫缺陷患者繼發(fā)侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的病例數(shù)量不斷上升，有研究表明，侵襲性真菌感染患者的死亡率超過50%[1,2]，早期確診對于治愈患者、降低死亡率有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的真菌實驗室診斷方法包括真菌鏡檢、培養(yǎng)以及組織病理學(xué)檢查等。分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展為IFI的診斷帶來了一場分子微生物學(xué)革命，通過對疾病早期病原體的微量核酸進行檢測，能快速進行鑒定，從而指導(dǎo)治療。與傳統(tǒng)方法相比，分子診斷技術(shù)大大縮短了診斷所需時間，敏感性和特異性也大幅提高，且操作簡便，易于重復(fù)，有利于規(guī)范化，為IFI的快速診斷提供了新的思路[3-5]。

本病案為1例臨床上難以判定病因的腦膜炎患者，曾考慮代謝性疾病、脫髓鞘疾病或結(jié)核性腦膜炎，但相應(yīng)治療效果不明顯。后考慮為隱球菌感染可能，經(jīng)腦脊液墨汁染色未發(fā)現(xiàn)典型的隱球菌莢膜特征；進行多次微生物培養(yǎng)，均未成功。最后通過對腦脊液樣本直接提取DNA進行PCR和DNA芯片的快速檢測，確定腦脊液中有隱球菌感染，并指導(dǎo)臨床用藥，使患者病情緩解。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

樣本 患者腦脊液樣本由長征醫(yī)院提供。

試劑 DNA提取試劑(美國Zymo公司，ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM)。PCR實驗相關(guān)試劑：PCR Mix(捷瑞生物工程有限公司)；ITS引物(捷瑞生物工程有限公司)，ITS4序列為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5序列為5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；瓊脂糖(美國 Lonza公司)；50×TAE(天根生化科技有限公司)。DNA芯片相關(guān)試劑耗材：醛基化玻片(上海百傲科技有限公司)；雜交液(組分為：4×SSC，0.3% SDS，5%甲酰胺，5×Denhardt)。銀染試劑：顯色A液(醋酸銀的水溶液，濃度4 mg/mL)；顯色B液(氫醌的檸檬酸緩沖液溶液，濃度10 mg/mL)。標記液：Streptavidin-HRP(Sigma)與稀釋液(1×BS+0.1%BSA)按照1∶1000的比例進行稀釋得到。量子點工作液：Streptavidin-Nanogold原液(Nanoprobes)與稀釋液(1×PBS+0.1%BSA)按照1∶40的比例稀釋。底物液：Biotin-Tyramine與稀釋液(1×PBS+0.1%BSA)按照1∶500的比例進行稀釋。5mL 50×Denhardts試劑：取50mg BSA、50mg Ficoll和50mg PVP，加5 mL水溶解，混勻。PBS緩沖液：800 mL水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，加水定容至1 L，高壓滅菌，保存于室溫。10% SDS：10 g SDS用去離子水溶解，定容至100 mL。20×PBST：取160 g NaCl，4g KCl，28.8 Na2HPO4，4.8 g KH2PO4，10 mL吐溫20，加水至1000 mL，振蕩混勻。20×SSC：稱取175.2g NaCl, 88.2 g檸檬酸鈉，溶于800 mL去離子水中，加入數(shù)滴10 mol/LNaOH溶液，調(diào)節(jié)PH至7.0，加去離子水定容至1L，分裝后滅菌，10×SSC、5×SSC、1×SSC可由20×SSC做相應(yīng)稀釋得到。

儀器 全自動樣本快速研磨儀(中國上海凈信科技有限公司)；離心機(美國Thermo公司)；渦旋振蕩器(中國其林貝爾公司)；恒溫金屬浴(中國卡尤迪公司)；NanoDrop分光光度計(德國IMPLEN公司)；Qubit 2.0 熒光計(美國Thermo Fisher公司)；E-gel凝膠電泳系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)；PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀(中國北京六一儀器廠)；凝膠成像儀(美國BIORAD公司)；芯片點樣儀(Pix Sys 5000 Cartesian Technologies)；基因芯片掃描儀(GenePix 4000B Axon Instruments)；生物芯片便攜式可視化芯片掃描儀(全軍傳染病分子診斷新技術(shù)重點實驗室研制)。

1.2 方法

樣本DNA提取 從腦脊液中提取總DNA：向ZR BashingBeadLysis Tube (0.1 mm&0.5 mm)中加入200 μL腦脊液，再加入750 μL Lysis Solution，按照試劑盒說明書操作。

PCR檢測ITS序列 PCR擴增：PCR體系(Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板1 μL)。擴增條件(95℃預(yù)變性4 min后，在95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min條件下進行30個循環(huán)，72℃延伸7 min)。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物片段。

DNA芯片制作 針對5種常見機會性感染真菌，選取隱球菌LAC1位點、煙曲霉CYP51A位點、白念珠菌SAP6位點、馬爾尼菲籃狀菌GASC位點、耶氏肺孢子菌18S位點作為檢測序列[6]，針對其保守區(qū)設(shè)計引物探針，最終篩選出了5對引物見表1，5條探針用于真菌檢測見表2。

表1 本研究使用的引物信息及序列

表2 本研究篩選后的探針信息及序列

Multiplex RT-PCR反應(yīng)條件 預(yù)變性95℃反應(yīng)10 min,變性94℃反應(yīng)30 s,退火溫度52℃反應(yīng)30 s，退火溫度72℃反應(yīng)30 s，設(shè)定45個循環(huán)，終延伸72℃反應(yīng)5 min。

DNA芯片的雜交、洗滌及可視化檢測 雜交及洗滌:PCR產(chǎn)物98℃熱變性5 min，冰浴5 min，與雜交液等體積混合，取10 μL加至各反應(yīng)區(qū)將芯片置于雜交盒，浸入45℃水浴中雜交1 h。雜交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2%SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC) 中于室溫各洗滌20 s，置室溫晾干。可視化檢測：①在芯片反應(yīng)區(qū)加入10 μL辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30 min；取出后用PBST洗液清洗20 s，重復(fù)3次，置室溫晾干。②在芯片反應(yīng)區(qū)加入10 μL的生物素—酪胺(biotin-tyramine)，37℃水浴放置30 min，用PBST洗液清洗20 s，重復(fù)3次，置室溫晾干。③在芯片反應(yīng)區(qū)加入10 μL Nanoprobes，37℃水浴放置30 min；取出后用PBST洗液清洗20 s，重復(fù)3次，用去離子水沖洗，置室溫晾干。④將銀染試劑A液和B液等體積混合，每個芯片反應(yīng)區(qū)立即避光加入混合液30 μL，待芯片上出現(xiàn)明顯可視化信號后停止顯色，用去離子水清洗，晾干。芯片雜交信號使用便攜式可視化生物芯片掃描儀進行掃描，用ArrayVision7.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)檢查

患者腦CT顯示右側(cè)腦膜有個白色的小亮點，疑似真菌感染形成的肉芽腫。腦脊液墨汁染色在40倍顯微鏡下發(fā)現(xiàn)疑似隱球菌孢子，但沒有莢膜，與常見引起腦膜炎的新生隱球菌的形態(tài)有所差別。

2.2 腦脊液樣本提取總DNA行分子診斷結(jié)果

PCR 電泳 將患者腦脊液提取的DNA進行ITS序列的擴增，其瓊脂糖電泳圖中見患者樣本和陽性對照在600 bp左右都有明顯條帶，陰性對照沒有條帶。見圖1。

DNA芯片結(jié)果 將患者腦脊液提取的DNA進行芯片檢測，在新生隱球菌列顯示陽性結(jié)果，見圖2。

3 討 論

ITS序列是真菌核糖體DNA序列間隔區(qū)的高度保守序列，可以依此設(shè)計引物，將擴增產(chǎn)物作為DNA Marker來判定樣本中是否存在真菌以及真菌的種屬鑒定[7]。該技術(shù)已在真菌實驗室診斷中較廣泛應(yīng)用，Rivera等[8]采用巢式PCR技術(shù)對隱球菌的鑒定可以達到飛摩爾(fmol)級別，具有高度的靈敏性和特異性。生物芯片技術(shù)自上世紀90年代進入快速發(fā)展的階段，至今已在諸多領(lǐng)域已得到廣泛地應(yīng)用，它可在平方厘米大小的固相介質(zhì)表面或液相介質(zhì)中用微加工技術(shù)構(gòu)建分析系統(tǒng)，根據(jù)分子間相互作用的原理，實現(xiàn)對核酸、蛋白質(zhì)等分子的快速、特異、高通量和自動化檢測，在病原微生物的感染診斷、基因分型、耐藥檢測等方面應(yīng)用廣泛，已有多種生物芯片產(chǎn)品用于臨床診斷[6,9]。

圖1ITS序列的電泳圖譜： “M”為DNA的marker；“-”為陰性對照；“Y”為患者樣本；“+”為新生隱球菌陽性對照；“N”為空孔圖2患者腦脊液提取的DNA在基因芯片上的檢測結(jié)果

Fig.1Electropherogram of ITS sequences：“M” is DNA marker；“-” is Negative control; “Y” is the patient sample; “+” is theCryptococcusneonatal positive control; “N” is the empty holeFig.2Detection of DNA extracted from cerebrospinal fluid in patient on gene chips

本文患者腦脊液直接提取的DNA經(jīng)過PCR擴增ITS序列，其電泳圖中有與隱球菌陽性對照相對應(yīng)的條帶，可以初步斷定其中有隱球菌的存在。但由于腦脊液墨汁染色未查見典型的隱球菌形態(tài)，所以又將腦脊液樣本DNA進行了芯片檢測分析進一步確證為隱球菌。

隱球菌腦膜炎診斷明確后，予兩性霉素聯(lián)合氟胞嘧啶及伏立康唑聯(lián)合抗真菌治療約10 d后，患者意識逐漸恢復(fù)，復(fù)查腦脊液壓力、腦脊液蛋白逐漸降低，復(fù)查頭顱MRI亦提示異常信號較前明顯降低，考慮抗真菌治療有效，繼續(xù)予聯(lián)合抗真菌治療約6個月后停止抗真菌治療。目前患者一般情況好，未訴頭痛等異常癥狀，復(fù)查腦脊液及頭顱MRI亦未見異常。

分子診斷技術(shù)為侵襲性真菌感染病原體的快速診斷提供了可能，基因芯片具有靈敏度高、通量高、多種微生物同時檢測等特點，試驗可在5 h內(nèi)完成，對于用傳統(tǒng)檢驗不能明確診斷的疑難、復(fù)雜感染病癥的診斷有非常廣闊的應(yīng)用前景。