王 毅 王 鵬 卜 燁 李凱敏 馮瑞剛

乳腺癌的發(fā)生受復雜的遺傳因素及生活生長環(huán)境協(xié)同影響，目前，BRCA1基因被認為是與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關系密切的重要抑癌基因，其在DNA損傷修復、細胞周期調控、細胞分裂分化等生命活動中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1基因突變使得其攜帶者罹患乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等惡性腫瘤的概率增高，其基因突變攜帶者終身患病風險高達80%[2]。此外，乳腺癌患者BRCA1基因突變更容易出現(xiàn)在家族性乳腺癌、早發(fā)性乳腺癌、三陰性乳腺癌等高危人群中。因此，本研究通過對散發(fā)性乳腺癌患者BRCA1 3個外顯子的高頻突變區(qū)進行基因擴增并測序，研究BRCA1基因突變位點與發(fā)病年齡、不同類型乳腺癌之間的相關性，為后續(xù)對乳腺癌的診斷與治療打下基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究隨機納入了本院2016年1月至2016年12月收治的172例散發(fā)性乳腺癌患者，年齡20～60歲，所有患者均經組織病理證實，且無其他原發(fā)腫瘤發(fā)生。本研究，排除家族性乳腺癌患者，即患者在具有血緣關系的三級親屬內不存在2名以上的乳腺癌親屬?；颊吣挲g28～56歲，平均年齡(42.13±11.72)歲。本研究已通過本院倫理委員會審核，且所有入組患者均簽訂患者知情同意書。在本研究治療同時，記錄患者基本信息及臨床檢測結果，包括病例ID號、姓名、性別、年齡等基本信息以及雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及乳腺癌Her-2等檢測結果。

1.2 乳腺癌分類標準

早發(fā)性乳腺癌：確診發(fā)病年齡<40歲，即按照早發(fā)性乳腺癌分類，發(fā)病年齡≥40歲，則為非早發(fā)性乳腺癌。三陰性乳腺癌：免疫組化學結合熒光原位雜交進行ER、PR及HER-2的陰陽性判定。其中，ER和PR通過免疫組織化學顯示：0判定為陰性，(+)、(++)、(+++)判定為陽性。HER-2通過免疫組織化學顯示：0或(+)判定為陰性，(+++)判定為陽性。若檢測出現(xiàn)(++)情況，則再行熒光原位雜交檢測該基因是否存在基因擴增，若存在擴增現(xiàn)象則為陽性，相反則判定為陰性。ER、PR、HER-2均陰性則定義為三陰性乳腺癌，其中任何一項陽性則定義為非三陰性乳腺癌。

1.3 BRCA1基因位點檢測

入組患者均抽取外周靜脈血2 ml并置于含EDTA的一次性真空采血管中。按照Qiagene全血基因組DNA提取試劑盒說明提取血液基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根據參考文獻[3-6]分別設計BRCA1基因的第2、10、11 3個外顯子的上下游引物，并由上海生工公司合成。PCR擴增體系為(50 μl)：10×buffer 5 μl、dNTP 0.4 μl(25 mmol/L)、DNA Polymerase 0.3 μl(5 U/μl)、DNA 1.5 μl、Primer(F+R) 2 μl(10 μmmol/L)、Mg2+3 μl(25 mmol/L)、ddH2O 37.8 μl。PCR擴增條件：預變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，36個循環(huán)后72 ℃后延伸10 min。電泳檢查PCR擴增情況，條帶清晰者送上海生工公司進行Sanger測序。

1.4 統(tǒng)計學分析

測序結果通過與Genebank(http//：www.ncbi.nlm.nih.gov)的BRCA1基因標準序列進行比對，分析基因位點的多態(tài)性。本研究采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，對基因突變組及基因無突變組之間基因多態(tài)性進行顯著性差異分析(P<0.05則具有統(tǒng)計學差異)，同時對BRCA1突變與乳腺癌患者年齡、早發(fā)性及三陰性的關系采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 BRCA1基因突變結果

本研究172例樣本中有15例發(fā)現(xiàn)了BRCA1基因突變，共計12個突變位點，基因突變頻率為8.72%。162A>G突變位于第2號外顯子上，導致異亮氨酸轉變?yōu)槔i氨酸。第10號外顯子上發(fā)現(xiàn)4個突變位點，1227G>A、2238T>C、2309G>A及2798T>C，其中2238T>C作為1個熱點突變位點在3個樣本中被發(fā)現(xiàn)。第11號外顯子上共發(fā)現(xiàn)7個突變位點(1504delTTAAA、2201C>T、2731T>C、3232A>G、3449insA、3537A>G、3667A>G)，其中存在2201C>T突變2例。此外，通過基因測序比對發(fā)現(xiàn)，第11號外顯子上存在缺失突變1例(1504delTTAAA)。該缺失突變?yōu)槟挲g28歲患者，屬于早發(fā)性乳腺癌，其5個密碼子的缺失導致后續(xù)氨基酸錯位合成，氨基酸編碼錯誤。另外，第11號外顯子上還存在插入突變1例，第3449位核苷酸序列上插入A堿基導致密碼子在1114位編碼終止。患者被診斷為乳腺癌的年齡為33歲，亦為早發(fā)性乳腺癌。BRCA1基因突變位點情況見表1。

表1 BRCA1基因突變位點

2.2 BRCA1突變與乳腺癌患者年齡、早發(fā)性、三陰性的關系

本研究中早發(fā)性乳腺癌患者BRCA1突變率7.87%(7/89)，非早發(fā)性乳腺癌患者突變率2.41%(2/83)，2組之間沒有統(tǒng)計學差異(χ2=2.578，P=0.108)。BRCA1基因突變患者平均年齡(43.73±4.90)歲，無突變患者平均年齡(51.12±5.13)歲，BRCA1突變組的發(fā)病年齡顯著低于無突變組(t=2.156，P=0.021)。三陰性乳腺癌者BRCA1突變9例(14.29%)，非三陰性乳腺癌患者BRCA1突變率為5.50%(6/109)，2組之間有統(tǒng)計學差異(χ2=3.867，P=0.049)。BRCA1突變與早發(fā)性乳腺癌及三陰性乳腺癌的關系見表2。

表2 BRCA1突變與早發(fā)性乳腺癌及三陰性乳腺癌的關系/例

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，BRCA1基因是最早檢測出的乳腺癌易感基因，且因其具有較高的外顯率，值得我們予以重視。BRCA1基因參與了多種細胞活動，尤其是細胞周期調控、DNA損傷修復、轉錄活性調節(jié)、誘導細胞凋亡等過程[1]。BRCA1基因突變可能會使編碼的基因產物改變，導致其腫瘤抑制作用降低或消失，使得患者乳腺癌發(fā)病風險增加60%～70%[7]。外顯子2、10及11突變是我國最常見的BRCA1基因突變，本研究選擇其突變高頻區(qū)域做研究對象，采集我院172位患者的外周血并提取DNA進行基因測序及相關分析，以了解本地區(qū)BRCA1基因的突變情況及其與不同乳腺癌的相關性。

BRCA1基因突變類型及突變頻率因地域和種族不同而具有較大差異。De Juan等[8]于495例散發(fā)性乳腺癌患者血樣中檢測到BRCA1/2突變率為10.51%。Al-Moghrabi等對155例乳腺癌患者的研究顯示，14.2%的乳腺癌患者檢測出BRCA1突變[9]。本研究172例樣本中通過Sanger測序發(fā)現(xiàn)15例BRCA1基因突變，基因突變頻率為8.72%。東西方人群由于生活環(huán)境及習慣、經濟發(fā)展、衛(wèi)生醫(yī)療保障的不同，BRCA1突變率也不盡相同，但通?？傮w突變率低于20%。然而，最近，一項基于二代測序技術下中國最大乳腺癌多基因測序研究發(fā)現(xiàn)，8085例患者中BRCA1/2的基因突變率為5.3%[10]。這種結果的差異受到幾方面的影響：其一，本研究樣本量不大，易造成抽樣偏差；其二，由于入組研究對象差異，本研究中入組對象年齡相對偏低。在中國，乳腺癌診斷的平均年齡為45～55歲，且隨著出生隊列效應造成的月經、生育模式的變化及生活生存環(huán)境的影響，乳腺癌的發(fā)病趨勢日益年輕[7]；其三，由于檢測技術及突變位點判定造成的差異。本研究采用的為傳統(tǒng)的Sanger測序，在判定標準中執(zhí)行任意位點發(fā)生突變、插入或缺失，則為BRCA1突變，因此某些位點的突變頻率不高。而在8085例患者的研究中，采用的技術為基于全外顯子測序的二代測序，在選擇突變位點方面，相比傳統(tǒng)技術針對性強，選擇位點突變頻率相對較高。本研究中，發(fā)現(xiàn)了3例2238T>C突變，2例2201C>T突變，這兩個位點可視為高頻突變位點。此外，第11號外顯子上還發(fā)現(xiàn)缺失突變(1504delTTAAA)1例，插入突變(3449insA)1例。Riahi等[11]在對早發(fā)性乳腺癌、家族性乳腺癌及卵巢癌綜合征的研究中報道過1504delTTAAA突變。3449insA突變則較為罕見，在上海、寧波地區(qū)得乳腺癌BRCA1基因突變研究中曾有過報道[3，12]。由于堿基插入或缺失造成的移碼突變及因單個堿基突變導致終止密碼子提前的無義突變約占總體致病性突變的70%。密碼子的缺失或插入造成移碼突變，使得氨基酸錯位合成，產生無意義的蛋白；單個堿基改變則導致后續(xù)片段提前終止，合成的蛋白質縮短，從而喪失了BRCA1的正常調控功能。值得注意的是，本研究密碼子發(fā)生插入和缺失的兩位患者發(fā)病年齡分別為28歲和33歲，且均為早發(fā)性乳腺癌及三陰性乳腺癌。

有資料顯示，BRCA1基因突變與早發(fā)性乳腺癌的發(fā)生有關。在早發(fā)性乳腺癌患者中，BRCA1突變率達到10%左右[13]。本研究中早發(fā)性乳腺癌患者BRCA1突變率7.87%(7/89)，略高于Sun Jie等的大樣本量病例研究[10]。此外，本研究BRCA1基因突變組患者平均年齡(43.73±4.90)顯著低于無突變患者(51.12±5.13)(P=0.021)。乳腺癌發(fā)病年齡最小的患者為28歲，為1504delTTAAA突變。朱安娜[4]研究中的1504delTTAAA突變患者為浸潤性導管癌伴淋巴結轉移，也是早發(fā)性乳腺癌。本研究對象未涉及具有乳腺癌家族史患者，但是年齡(<40歲)已經成為影響家族性乳腺癌的一個因素，而且這些患者的病理特征差，預后不佳。因此，臨床上應注意BRCA1基因突變的早發(fā)性乳腺癌患者。

BRCA1致病性突變的乳腺癌患者的病理特征類似于基底樣型乳腺癌，即三陰性乳腺癌。BRCA1基因突變導致其同源重組、DNA損傷修復及轉錄調控功能受阻，被認為是引起三陰性乳腺癌的關鍵因素之一。三陰性乳腺癌檢出率高、惡性程度高、治療及預后差，值得我們予以重視[14]。有研究顯示，近90%BRCA1突變者被診斷為三陰性乳腺癌，在無BRCA1突變患者中三陰性乳腺癌比例僅14.6%～34.0%[15-16]。本研究中，BRCA1突變組被診斷為三陰性乳腺癌者9例，所占比例為14.29%(9/63)，BRCA1無突變組三陰性乳腺癌患者比例為5.5%(6/109)，兩組之間有顯著性差異(P=0.049)，表明BRCA1基因突變攜帶者患三陰性乳腺癌的風險更大。本研究也存在一定的不足，比如樣本量偏小造成的取樣偏差，地域位置不同造成的影響，基因檢測區(qū)域局限性影響等。但相比二代測序，從經濟投入產出比角度考慮，采用Sanger測序進行BRCA1基因突變進行乳腺癌的診斷，可以更快地適應于臨床檢測中。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BRCA1基因突變患者的發(fā)病年齡低于無突變患者，且三陰性乳腺癌BRCA1基因突變檢出率顯著高于非三陰性乳腺癌患者，提示BRCA1基因突變可能使乳腺癌發(fā)病年齡趨于低齡化，影響患者治療及預后。