楊德毅，吾建祥*，劉莉，刁銀軍，朱麗燕，虞冰，馬婧妤

(1.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 321007； 2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321017；3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321007)

阿維菌素(avermectin，ABA)是1976年由日本北里大學(xué)學(xué)者Takahito Omur等和美國Merck公司首先開發(fā)研制的殺蟲劑，是由灰色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一類十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(emamectin benzoate，EMA)是美國Merck公司1984年在阿維菌素B1基礎(chǔ)上合成的一種高效抗生素殺蟲劑。其殺蟲活性是阿維菌素的103倍，殺蟲譜更廣[1]。阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在茭白生產(chǎn)中常用于防治綠飛虱、螟蟲、蚜蟲等蟲害[2-4]。GB 2763—2016中茭白中的阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽最大殘留限量未作規(guī)定，但近年來研究表明，該2種農(nóng)藥若不合理使用，對生態(tài)環(huán)境和人類健康存在較大風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。本研究參照NY/T 761—2008和GB/T 20769—2008前處理方法和檢測方法，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)同時測定茭白中阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留量的分析方法；根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[7]、CNAS—GL06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[8]中規(guī)定的程序與方法和相關(guān)文獻(xiàn)[9-13]，對該方法進(jìn)行不確定度評估，分析不確定度的主要來源，尋求影響不確定度的最大因素，并通過相應(yīng)的措施減少不確定度對結(jié)果帶來的影響，為檢測機(jī)構(gòu)質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)，為用LC-MS/MS測定其他農(nóng)藥殘留的不確定度評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

測試材料為茭白，系金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院基地種植的本地品種茭白。

試劑有乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙酸銨(優(yōu)級純)；甲醇中阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg·L-1±0.6%)、甲醇中甲氨基阿維菌素甲酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg·L-1±0.6%)，購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；NH2氨基萃取柱，天津博納艾杰爾科技有限公司生產(chǎn)。

所用儀器與設(shè)備有液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，T25均質(zhì)器(德國IKA公司)，S-EVAP氮?dú)獯蹈蓛x(美國Organomation公司)，固相萃取裝置(美國Supelco公司)，電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，超純水儀(美國Milli-pore公司)，渦旋振蕩器(美國Thermo公司)，移液器(德國艾本德公司)及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

將茭白樣品切碎，充分混勻，采用四分法縮分后，經(jīng)食品加工器搗碎，裝入封口容器中，貼上標(biāo)簽，-20 ℃保存，待測。

準(zhǔn)確稱取25.0 g樣品(精確至0.01 g)于250 mL燒杯中，加入50 mL乙腈和50 mL超純水，勻質(zhì)器(轉(zhuǎn)速1 300 r·min-1)充分勻漿2 min后經(jīng)濾紙過濾至裝有10.0 g氯化鈉的具塞量筒中，濾液劇烈振蕩1 min后，靜置20 min，用移液器轉(zhuǎn)移10 mL上清液至小燒杯中，氮吹至近干，待凈化[14]。

上述濃縮樣品用2.0 mL二氯甲烷+甲醇(95 mL+5 mL)溶解后過NH2萃取柱。該小柱先用4.0 mL二氯甲烷+甲醇(95 mL+5 mL)預(yù)淋條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時，立即倒入樣品溶液，用15 mL尖底刻度離心管接收洗脫液，用4 mL二氯甲烷+甲醇(95 mL+5 mL)潤洗燒杯后淋洗NH2萃取柱，并重復(fù)1次。將盛有淋洗液的刻度離心管置于水浴(50 ℃)氮吹儀上氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇在刻度離心管內(nèi)定容至5.0 mL，旋渦混勻，移入2 mL自動進(jìn)樣器樣品瓶中，待測[15]。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別用1 mL的單標(biāo)線吸量管各吸取1 mL阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液和甲氨基阿維菌素甲酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用1 mL的單標(biāo)線吸量管和10 mL容量瓶逐級稀釋上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別得到1 mg·L-1、100 μg·L-1、10 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；吸取5 mL 1 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL容量瓶中，得到500 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；吸取1 mL 500 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至25 mL容量瓶中，得到20 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；用1 mL的單標(biāo)線吸量管和10 mL容量瓶逐級稀釋500 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別得到50 μg·L-1、5 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

按上述方法，得到質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：Phenomenex Luna(150 mm×2.0 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動相A：甲醇，流動相B：0.1%乙酸銨水溶液；流速：0.2 mL·min-1，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子模式(Ionization Mode)：電噴霧正離子源ESI+；毛細(xì)管電壓(Capillary)：3.00 kV；離子源溫度(Source Temperature)：150 ℃；錐孔反吹氣流量(Cone Gas Flow)：40 L·h-1；脫溶劑氣溫度(Desolvation Temperature)：500 ℃；脫溶劑氣流量(Desolvation Gas Flow)：800 L·h-1；母離子m/z：886.2；子離子m/z：158.2(定量離子)、126.1；錐孔電壓：80、80 V；碰撞能量：50、62 eV。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)測量的原理建立測量值的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行不確定度來源的分析。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，數(shù)學(xué)模型：

X=cV1V3÷V2÷m。

式中：X為樣品中被測組分的含量(μg·kg-1)；c為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中被測組分的濃度(μg·L-1)；V1為提取溶劑總體積(mL)；V2為吸取用于檢測的提取溶液體積(mL)；V3為試樣溶液最終的定容體積(mL)；m為試樣的質(zhì)量(g)。

1.2.5 不確定度分量的主要來源

根據(jù)該方法測量過程，測定茭白樣品中阿維菌素和甲氨基阿維菌素甲酸鹽殘留量的不確定度的來源主要包括標(biāo)準(zhǔn)品的引入、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、樣品稱量、試樣轉(zhuǎn)移和定容、測量重復(fù)性、回收率引入等。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一因素不確定度

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，阿維菌素和甲氨基阿維菌素甲酸鹽的純度誤差均為±0.6%；按B類評定取矩形分布，由標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對不確定度(urel(sp))：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的不確定度

玻璃量器引入的不確定度。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》[16]檢定規(guī)程規(guī)定的最大允許誤差，按以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中玻璃量具允差引起的相對不確定度(表2)，配制過程中所用的玻璃量具均為A級，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的不確定度(urel(sv))：

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中玻璃量器引入的 不確定度

根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中玻璃量器與移液器引入的相對不確定度為：

urel(sv)=

0.011 1。

由環(huán)境溫度變化引入的不確定度(urel(st))。標(biāo)準(zhǔn)溶液在稀釋過程中的溶劑為甲醇，實(shí)驗(yàn)溫度為(20±5)℃范圍內(nèi)時(溫度波動為5 ℃)，甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 19 ℃-1，玻璃量器的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)小于液體的膨脹系數(shù)，忽略不計(jì)，根據(jù)以下公式計(jì)算環(huán)境溫度變化引起的相對不確定度，計(jì)算結(jié)果見表3。

根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過程中由溫度變化引入的相對不確定度：

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度變化引入的 不確定度

urel(st)=

0.013 7。

合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的不確定度(urel(svt))。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程，2 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過程中引入的相對不確定度相同，合成 2 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程由玻璃量具和溫度引入的相對不確定度為：

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度

通過對質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100 μg·L-1的阿維菌素和甲氨基阿維菌素甲酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測定1次，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與峰面積曲線，各數(shù)據(jù)結(jié)果詳見表4。

同時按照上述方法對在田間施用過2種農(nóng)藥的陽性茭白樣品進(jìn)行3次平行測定，測得兩種樣品溶液平均值c0(ABA)=25.15 μg·L-1、c0(EMA)=108.6 μg·L-1(根據(jù)1.2.4節(jié)公式計(jì)算陽性樣品平均殘留量X0，結(jié)果見表5)，根據(jù)以下公式對標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4 校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)及不確定度

表5 陽性樣品測定結(jié)果

2.1.4 試樣質(zhì)量稱量引入的不確定度

稱量時稱取25.0 g(精確到0.1 g)的試樣，根據(jù)鑒定證書天平最大允許誤差為±0.05 g，按B類評定取矩形分布，由試樣稱量引入的相對不確定度(urel(dm))：

2.1.5 試樣轉(zhuǎn)移和定容引入的不確定度

在樣品前處理過程中溫度變化范圍為(20±5)℃，用移液器轉(zhuǎn)移10 mL乙腈溶液(膨脹系數(shù)為0.001 37 ℃-1)，最終用甲醇在15 mL尖底刻度離心管定容至5 mL，根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[17]，10 mL移液器的最大允許誤差為±0.6%，根據(jù)JJG 10—2005《專用玻璃量器檢定規(guī)程》[18]10 mL尖底刻度離心管最大允差為±0.2 mL，尖底刻度離心管、移液器及溫度變化取矩形分布，按上述2.1.2方法分別計(jì)算移液器、玻璃量具引入的相對不確定度urel(dv)、溫度引入的相對不確定度urel(dt)及合成試樣轉(zhuǎn)移和定容引入相對不確定度(urel(dvt))，結(jié)果見表6。

由表6數(shù)據(jù)合成試樣轉(zhuǎn)移和定容過程引入的相對不確定度：

表6 前處理過程中移液器和玻璃量具的 相對不確定度

2.1.6 由測量重復(fù)性引入的不確定度

在田間施藥后取回的陽性茭白樣品經(jīng)3次重復(fù)測定的結(jié)果見表5，按照農(nóng)藥殘留取樣及測定的要求，對樣品充分混勻、加大樣品的制樣量及科學(xué)縮分方式保障試樣的均勻性和檢測結(jié)果的代表性。同時按A類評定對其不確定度(urel(df))進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式：

計(jì)算得出由測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel(df(ABA))=0.016 97；urel(df(EMA))=0.003 446。

2.1.7 回收率引入的不確定度

在空白試樣中添加 5 組不同的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，按 A 類進(jìn)行評定，由回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度(urel(dr))根據(jù)如下公式計(jì)算，該方法的回收率及標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表5。

按照以下計(jì)算公式對回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，對照t檢驗(yàn)臨界值分布表(f=n-1=4)得雙側(cè)臨界值t(0.05,4)為2.776。按照以上t值公式計(jì)算檢驗(yàn)值t(表7)均大于2.776，因此與回收率100%有顯著差異，在計(jì)算結(jié)果時必須采用回收率進(jìn)行修正。修正后陽性茭白樣品中阿維菌素和甲氨基阿維菌素甲酸鹽殘留量為：

表7 回收率和不確定度

因此由回收率引起的相對不確定度為：

2.1.8 進(jìn)樣體積引入的不確定度

LC-MS/MS 配備的微量注射器體積為 10 μL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為±1%，樣品上機(jī)進(jìn)樣量為 5 μL，按均勻分布，由體積引入的相對不確定度(urel(ev))：

2.2 復(fù)合因素不確定度

2.2.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

LC-MS/MS 法同時測定茭白中阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留的相對不確定度分量見表8，相對合成不確定度(urel(c))計(jì)算公式：

表8 相對不確定度的分量及相對合成不確定度值

注：SP，標(biāo)準(zhǔn)品純度；SVT，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；SW，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合；DM，樣品稱量； DVT，試樣轉(zhuǎn)移和定容；DF，測量重復(fù)性；DR，回收率；EV，進(jìn)樣體積。

分別計(jì)算阿維菌素和甲氨基阿維菌素甲酸鹽的相對合成不確定度為：

urel(c(ABA))=0.0516 00；urel(c(EMA))=0.038 700。

根據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算公式uc(X)=urel(X)×X0，其中X0為表5中實(shí)測陽性茭白樣品中殘留量的平均值，分別計(jì)算得到阿維菌素和甲氨基阿維菌素甲酸鹽的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：uc(X(ABA))=1.298；uc(X(EMA))=4.203。

2.2.2 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[19]，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度u=k×uc(X)，陽性樣品中阿維菌素和甲氨基阿維菌素甲酸鹽殘留量及不確定度評定結(jié)果見表9。

表9 不確定度的評定結(jié)果

2.3 影響不確定度因素

從各相對不確定度分量值(表8)看出，用LC-MS/MS法同時測定茭白中阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留量產(chǎn)生的相對不確定度范圍分別在0.001 155～0.034 620和0.001 155～0.027 300，影響相對不確定度主要因素為配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、試樣轉(zhuǎn)移和定容等(圖1)。

圖1 測定茭白中阿維菌素和甲氨基阿維菌素 苯甲酸鹽不確定度來源

3 小結(jié)與討論

通過對茭白中阿維菌素和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留量測定過程中引入的各相對不確定度評定分析，結(jié)果表明，測定茭白中阿維菌素殘留量的過程中對不確定度貢獻(xiàn)較大的因素依次為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、試樣轉(zhuǎn)移和定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制；測定茭白中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的過程中對不確定度貢獻(xiàn)較大的因素依次為試樣轉(zhuǎn)移和定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。其中在試樣轉(zhuǎn)移和定容過程中相對不確定度較大原因主要為定容過程中刻度離心管最大允許誤差較大引入。因此，在實(shí)際檢測過程中，可通過改進(jìn)前處理等方法、選擇高精密度的量器、提高檢測人員業(yè)務(wù)水平和操作的規(guī)范性、選擇高純度的標(biāo)準(zhǔn)品等方法減小測量數(shù)據(jù)的不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。