溫雪婷，朱江群，朱建芬，肖英平，李娜，楊華*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.余杭區(qū)余杭街道農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江 杭州 311100； 3.余杭區(qū)塘棲鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江 杭州 311106； 4.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

動(dòng)物腸道內(nèi)寄居著大量共生微生物，包括真菌、細(xì)菌、古菌及病毒，其中真菌是腸道菌群的重要組成部分，結(jié)構(gòu)受日齡、性別、飼糧、品種、地域、藥物、疾病等因素的影響[1]。與其他腸道菌相比，腸道真菌的豐度和多樣性較低，存在明顯的個(gè)體差異[2-3]，且其組成并不穩(wěn)定，不同時(shí)間真菌組成相似性低[4-6]。由于真菌在腸道中的豐度低、含量少，因此通用引物擴(kuò)增真菌DNA時(shí)會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果，在某種程度上限制了腸道真菌的研究。

在正常情況下，腸道內(nèi)細(xì)菌、病毒和真菌菌群之間存在穩(wěn)定的對(duì)抗、協(xié)同或共生關(guān)系[7-8]。腸道中真菌多樣性分布可能是飲食和環(huán)境因素的體現(xiàn)，同時(shí)也是真菌菌群同宿主腸道免疫系統(tǒng)，以及土著微生物與外源真菌之間相互作用的體現(xiàn)。真菌可通過(guò)與細(xì)菌的相互作用從而改變腸道生物屏障[9-10]，引起腸道通透性增加，導(dǎo)致腸腔內(nèi)真菌易位到腸腔以外部位并引起侵襲性感染。消化道真菌感染可由腸道正常真菌菌群或是外來(lái)的致病菌引發(fā)，真菌性食管炎及胃炎的主要致病菌為白色念珠菌，毛霉菌屬、念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等可導(dǎo)致腸道的真菌性炎癥[1,11]。不同腸段優(yōu)勢(shì)真菌與真菌結(jié)構(gòu)不同[12]，研究還發(fā)現(xiàn)人類(lèi)肥胖組與非肥胖組的腸道真菌多樣性存在差異，肥胖組的真菌多樣性較非肥胖組降低，毛霉菌在非肥胖組中檢測(cè)率最高，毛霉屬的相對(duì)豐度與體質(zhì)量降低程度呈正相關(guān)[13-14]。

本研究旨在利用高通量測(cè)序技術(shù)比較不同生長(zhǎng)速率肉雞盲腸真菌組成差異，探索肉雞腸道真菌結(jié)構(gòu)與雞生長(zhǎng)速率的關(guān)系，為正確定義“肉雞健康腸道真菌菌群”提供更多理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與采樣

選擇10 000只羅斯308肉雞常規(guī)飼養(yǎng)。1～2日齡時(shí)，提供24 h的光周期，飼養(yǎng)溫度32～34 ℃；隨后提供16 h的光周期，溫度每周減少2～3 ℃，至20 ℃。所有肉雞飼喂相同配合飼料，隨意采食[15]。38日齡時(shí)，從中隨機(jī)挑選600只公雞，選取其中體質(zhì)量最高的8只作雞H組，(3 146.25±92.57)g，體質(zhì)量中等的8只雞作M組，(2 212.5±14.88)g和體質(zhì)量最低的8只雞作L組，(1 127.5±93.16)g。頸椎脫位處死，屠宰后立刻取其盲腸內(nèi)容物，標(biāo)記為H1～H8、M1～M8和L1～L8，液氮冷凍，-80 ℃儲(chǔ)存待測(cè)。

1.2 DNA提取、擴(kuò)增與高通量測(cè)序

使用DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取樣本DNA，并存儲(chǔ)于-80 ℃。以提取的DNA為模板，使用ITS2引物ITS3-2024F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4-2409R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ITS測(cè)序分析，由llumina HiSeq 2500平臺(tái)測(cè)序[4]。

1.3 序列分析與系統(tǒng)分類(lèi)

采用QIIME軟件(V1.7.0)進(jìn)行序列的質(zhì)量控制及過(guò)濾，剔除低質(zhì)量的DNA序列。在QIIME中調(diào)用uCLUST對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度97%進(jìn)行聚類(lèi)，定義為操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit，OTU)。利用聚類(lèi) OTUs 構(gòu)造稀釋曲線(xiàn)，并用 QIIME計(jì)算各樣品的α多樣性指數(shù)(ChaoⅠ、ACE、Simpson、 Shannon和覆蓋度指數(shù))，并用R軟件包(Version 2.15.3)顯示。使用Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有OTU的代表性序列進(jìn)行物種匹配，在門(mén)和屬的水平上對(duì)樣品的真菌組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到菌群分布結(jié)果，并繪制柱狀圖。進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)和聚類(lèi)分析，對(duì)樣本間物種多樣性差異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性

通過(guò)Chao1豐富度估計(jì)量、ACE指數(shù)計(jì)算菌群豐度，香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson diversity index)計(jì)算菌群多樣性，覆蓋率指數(shù)(Coverage index)刻畫(huà)序列深度(表1)。研究發(fā)現(xiàn)，最低體質(zhì)量組雞盲腸內(nèi)容物真菌豐度最高(Chao1：451.352，ACE：438.521)，最高體質(zhì)量組雞盲腸內(nèi)容物菌群多樣性最高(Shannon指數(shù)：4.413，Simpson指數(shù)：0.838)。所測(cè)樣品覆蓋率指數(shù)均超過(guò)99.8%，表明本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本的真實(shí)情況。

表1 各供試組的α多樣性指數(shù)

2.2 腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)分布

稀釋曲線(xiàn)用于評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有類(lèi)群，并間接反映樣品中物種的豐富程度。取樣943 0 reads，隨著取樣reads的增加，新發(fā)現(xiàn)的OTUs減少，取樣565 80 reads時(shí)，稀疏曲線(xiàn)趨于飽和(圖1)。這表明，樣本庫(kù)的大小足以估計(jì)相似閾值97%的菌種豐度和真菌群落多樣性。

圖1 腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)分布的稀疏曲線(xiàn)

研究發(fā)現(xiàn)，所有序列可分為5個(gè)門(mén)：球囊菌門(mén)(Glomeromycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和子囊菌門(mén)(Ascomycota)(圖2)。豐度最高的10個(gè)屬分別為念球菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、曲霉屬(Aspergillus)、哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)、刺盤(pán)孢屬(Colletotrichum)、赤霉菌屬(Gibberella)、微囊菌屬(Microascus)、Phialemoniopsis、鏈格孢屬(Alternaria)和木霉屬(Trichoderma)。在門(mén)水平上，子囊菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；在屬水平上，不同組腸道真菌沒(méi)有明顯的規(guī)律，樣本間個(gè)體差異大。

2.3 菌群聚類(lèi)分析和主坐標(biāo)分析

為了對(duì)各組腸道真菌群落進(jìn)行比較，進(jìn)行聚類(lèi)分析與主坐標(biāo)分析(PCoA)。聚類(lèi)分析根據(jù)OUT數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，選取數(shù)目最多的35個(gè)菌屬，基于R熱點(diǎn)圖進(jìn)行作圖，熱圖中的每1個(gè)色塊代表1個(gè)樣品在1個(gè)屬水平上的豐度。不同分組橫向排列，屬縱向排列，對(duì)樣品進(jìn)行聚類(lèi)，從聚類(lèi)中可以了解樣品之間的相似性以及屬水平上的群落構(gòu)成相似性(圖3)。研究發(fā)現(xiàn)，最低體質(zhì)量組腸道真菌豐度較高的有德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、小囊屬(Microascus)、毛霉菌(Mucor)等。

圖2 不同樣品中真菌群落組成

圖3 真菌結(jié)構(gòu)的熱點(diǎn)

主坐標(biāo)分析PCoA沒(méi)有改變樣品點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系，只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。通過(guò)PCoA可以觀察個(gè)體或群體間的差異。每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)樣本，相同顏色的點(diǎn)來(lái)自同1個(gè)分組，兩點(diǎn)之間距離越近表明兩者的群落構(gòu)成差異越小(圖4)。研究發(fā)現(xiàn)，最低體質(zhì)量組與最高體質(zhì)量組肉雞腸道真菌群落構(gòu)成差異較大，最低體質(zhì)量組與中等體質(zhì)量組、中等體質(zhì)量組與最高體質(zhì)量組肉雞腸道真菌群落構(gòu)成差異較小。最低體質(zhì)量組與中等體質(zhì)量組組內(nèi)個(gè)體差異較最高體質(zhì)量組小。

圖4 菌群的主坐標(biāo)分析

3 小結(jié)

肉雞腸道真菌序列聚集成2 759個(gè)OTUs，分為5個(gè)菌門(mén)：球囊菌門(mén)(Glomeromycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和子囊菌門(mén)(Ascomycota)。豐度最高的10個(gè)屬分別為念球菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、曲霉屬(Aspergillus)、哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)、刺盤(pán)孢屬(Colletotrichum)、赤霉菌屬(Gibberella)、微囊菌屬(Microascus)、Phialemoniopsis、鏈格孢屬(Alternaria)和木霉屬(Trichoderma)。α多樣性指數(shù)表明，最低體質(zhì)量組真菌的豐度最高，其次為中等體質(zhì)量組和最高體質(zhì)量組；最高體質(zhì)量組的菌群多樣性最高，其次為中等體質(zhì)量組和最低體質(zhì)量組。肉雞腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)，屬水平上腸道真菌有較大的個(gè)體差異。最低體質(zhì)量組與最高體質(zhì)量組肉雞腸道真菌群落構(gòu)成差異較大。已知曲霉菌、毛霉菌可導(dǎo)致腸道真菌性炎癥，毛霉屬的相對(duì)豐度與體質(zhì)量降低程度呈正相關(guān)[13]，通過(guò)熱點(diǎn)圖可知，最低體質(zhì)量肉雞腸道組曲霉菌屬(Aspergillus)、毛霉菌(Mucor)豐度較高。